Как в лабораторных условиях определяют индекс бгкп и общую обсемененность продуктов

Лабораторная работа №4. Определение общей микробиологической обсемененности продуктов питания

4.1.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Задача
микробиологического контроля
– возможно быстрое обнаружение и выявление
путей проникновения микроорганизмов-вредителей
в производство, очагов и степени
размножения их на отдельных стадиях
технологического процесса, предотвращение
развития посторонней микрофлоры путем
использования различных профилактических
мероприятий.

Микробиологический
контроль проводится заводскими
лабораториями систематически. При
отсутствии микробиологической лаборатории
на предприятии указанный контроль может
осуществляться по хоздоговору с органами
Госсанэпиднадзора или лабораториями,
аккредитованными для проведения
микробиологических исследований.

Он
осуществляется на всех этапах
технологического процесса, начиная с
сырья и кончая готовым продуктом на
основании утвержденных государственных
стандартов (ГОСТ), технических условий
(ТУ), инструкций, медико-биологических
требований и санитарных норм качества
продовольственного сырья и пищевых
продуктов, а также другой нормативной
документации. Для отдельных производств
имеются свои схемы микробиологического
контроля, в которых определены объекты
контроля, точки отбора проб, периодичность
контроля, указаны микробиологические
показатели, которые необходимо определять,
приводятся нормативы по этим
микробиологическим показателям.

Многие
пищевые продукты являются благоприятной
средой для роста и развития посторонних
микроорганизмов.

Кроме
того, при несоблюдении санитарных правил
и норм работниками пищевого предприятия
в продукты могут попасть патогенные
микроорганизмы – возбудители пищевых
инфекций. Поэтому важнейшими
характеристиками продовольственных
товаров являются их безопасность
и
микробиологическая
стойкость.

Под
безопасностью понимают отсутствие
вредных примесей химической и биологической
природы, в том числе патогенных
микроорганизмов и ядовитых продуктов
их жизнедеятельности. Понятие
«микробиологическая стойкость»
подразумевает потенциальные возможности
сохранения продукта без порчи.

Микрофлора
пищевых продуктов представляет собой
сложную динамическую систему, связанную
с внешней средой. Это значительно
осложняет способы ее исследования и
трактовку полученных результатов.

Для
оценки качества пищевых продуктов, а
также условий их производства и хранения
пользуются количественными и качественными
показателями. Количественные
показатели указывают общее число микроорганизмов
определенных групп в 1 г (см3)
продукта. Качественные
показатели
указывают на отсутствие (присутствие)
микробов конкретных видов в определенной
массе продукта.

1. Группы микробиологических критериев безопасности

пищевых
продуктов

1.
Группа показателей санитарного состояния

Непосредственное
выявление патогенных микроорганизмов
(возбудителей пищевых инфекций) в пищевых
продуктах невозможно из-за низкого их
содержания в продукте по сравнению с
содержанием сапрофитной микрофлоры.

Поэтому при санитарной оценке пищевых
продуктов используют косвенные методы,
позволяющие определить уровень
загрязнения продукта выделениями
человека.

Чем выше этот уровень, тем
вероятнее попадание в объект патогенных
микроорганизмов – возбудителей кишечных
инфекций.

Общая
бактериальная обсемененность (КМАФАнМ)
– количество мезофильных аэробных и
факультативно-анаэробных микроорганизмов
в 1 г или 1 см3
продукта. В нормативной документации
указывают предельное содержание этих
микроорганизмов в единицах КОЕ
(колониеобразующих единицах).

Высокая
бактериальная обсемененность пищевых
продуктов свидетельствует о недостаточной
термической обработке сырья, недостаточно
тщательной мойке и дезинфекции
оборудования, неудовлетворительных
условиях хранения и транспортировки
продукции.

Общую
бактериальную обсемененность определяют
в продуктах, в которых отсутствует
технически полезная микрофлора
(микрофлора заквасок). Для определения
этого показателя используют универсальные
питательные среды: мясопептонный агар
(МПА) или среду для определения количества
мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов.

Наличие
бактерий группы кишечной палочки (БГКП)
определяется во всех жидких продуктах,
во всех продуктах животного происхождения
(за исключением стерилизованных), во
многих продуктах растительного
происхождения.

БГКП объединяют
представителей нормальной микрофлоры
кишечника человека и относятся к
семейству Enterobacteriaceae
родов Escherichia,
Citrobacter,
Enterobacter,
Klebsiella,
Serratia.

Выбор
БГКП в качестве санитарно-показательных
микроорганизмов для оценки санитарного
состояния пищевых продуктов не случаен.
Санитарно-показательные микроорганизмы
должны отвечать следующим требованиям:

• Эти микроорганизмы должны являться представителями нормальной микрофлоры организма, в нем развиваться и размножаться;
• Они должны в больших количествах выделяться из организма;
• В окружающей среде они должны длительное время сохранять свою жизнеспособность, но не размножаться;
• Они не должны изменяться под действием факторов внешней среды, подавляться или стимулироваться другими микроорганизмами;
• Эти микроорганизмы должны равномерно распределяться в исследуемых объектах внешней среды;
• Определение этих микроорганизмов должно осуществляться простыми методами.

В
нормативных документах обычно указывается
количество продукта, в котором БГКП не
допускаются.

При
высоком уровне загрязнения продукта
БГКП возрастает вероятность нахождения
в нем патогенных микроорганизмов –
возбудителей кишечных инфекций
(дизентерии,
брюшного тифа, холеры и др.).

Для определения
БГКП применяют накопительную среду
Кесслера, а идентификацию этих бактерий
проводят с использованием
дифференциально-диагностической среды
Эндо.

2.
Группа
условно-патогенных микроорганизмов.
К
этой группе относятся микроорганизмы
– возбудители пищевых отравлений, таких
как Proteus
vulgaris,
Clostridium
perfringens,
Bacillus
cereus,
Staphylococcus
aureus,
Clostridium
botulinum.

Условно-
патогенные микроорганизмы являются
микроорганизмами, которые постоянно
присутствуют в окружающей среде и в
живых макроорганизмах.

Таким образом, многие из
вышеперечисленных микроорганизмов
нормируются в колбасных изделиях и
других мясных продуктах.

В
мясных и многих растительных консервах
нормируют содержание сульфитредуцирующих
клостридий, которые развиваются в
анаэробных условиях.

В
молочных продуктах, богатых белком
(например, твороге, сыре) нормируется
содержание коагулазоположительного
золотистого стафилококка (Staphylococcus
aureus)
– возбудителя пищевой интоксикации.

При
определении условно-патогенных
микроорганизмов используют элективные
питательные среды.

Например, наличие
золотистого стафилококка выявляют с
помощью молочно-солевого (МСА) или
желточно-солевого (ЖСА) агара.

1. Группа патогенных микроорганизмов

Из
патогенных микроорганизмов в пищевых
продуктах определяют сальмонеллы.
Проводят исследования на наличие
сальмонелл органы Санэпиднадзора.
Обычно, сальмонеллы не допускаются в
25 г (см3)
продукта. В некоторых продуктах детского
и диетического питания не допускается
наличие сальмонелл в 50 и даже в 100 г
(см3).

Для
определения сальмонелл используют
накопительные питательные среды
(селенитовую, Кауфмана, Мюллера) и
дифференциально-диагностические среды
(Плоскирева, Левина).

4.
Группа показателей микробиологической
стабильности продукта.
К этой группе относятся микроскопические
грибы и дрожжи, которые, как известно,
являются возбудителями порчи продукта.

Этот показатель нормируется многих
продуктах из растительного сырья, а
также в продуктах животного происхождения
с растительными добавками. Динамику
роста грибов и дрожжей обязательно
исследуют при установлении сроков
годности и режимов хранения новых видов
продуктов.

Кроме
вышеперечисленных нормируемых
микробиологических показателей для
прогнозирования качества выпускаемой
пищевой продукции целесообразно
определять отдельные группы микроорганизмов,
которые являются представителями технически полезной и технически
вредной микрофлоры.

Так,
в производстве сыров периодически
определяют гнилостные бактерии как
основные возбудители порчи сыров, а
также следят за развитием полезных
микроорганизмов (молочнокислых и
пропионовокислых бактерий) в процессе
выработки сыров.

4.1.2
Понятие о системе критических контрольных
точек (НАССР)

В
целях гарантии качества выпускаемой
пищевой продукции, ее безопасности за
рубежом активно внедряется система
критических контрольных точек (НАССР)
в качестве основы экспертизы пищевых
продуктов. НАССР расшифровывается как
Hazard
Analysis
Critical
Control
Paint
(критические пределы надзора вредных
факторов).

Характерной
особенностью данной системы является
планомерный надзор и контроль пищевых
продуктов при предварительном определении
всех возможных факторов, связанных с
полным циклом обращения с пищевыми
продуктами.

Этот надзор начинается с
контроля условий выращивания животных
и контроля условий произрастания
растений; с контроля среды обитания
промысловых животных и гидробионтов.
Далее проводят контроль условий получения
сырья, и контроль производства
определенного продукта из этого сырья.

Заканчивается надзор исследованием
готового продукта после его приготовления, хранения, транспортировки и реализации.

Эта
система существенно отличается от ранее
применявшегося метода санитарно-гигиенического
контроля и надзора, в котором основное
внимание было уделено надзору лишь
конечных продуктов.

Международным
комитетом по стандартизации микроорганизмов
пищевых продуктов (ICMSF)
рекомендовано Всемирной Организации
Здравооохранения (ВОЗ) внедрить НАССР
в международный стандарт. В настоящее
время в странах ЕС считается обязательным
обработка и производство импортированных
мяса и морепродуктов с применением
системы НАССР.

1. Микробиологический контроль качества некоторых

пищевых
продуктов

Источник: https://StudFiles.net/preview/4521205/

Приборный экспресс-метод контроля общей бактериальной обсемененности молока-сырья

Г.М. Свириденко, д. т. н., М.Б. Захарова, к. т. н., ФГБНУ «ВНИИМС»;

Микробиологические процессы, начиная с сырья, являются ключевыми, определяющими качество молочной продукции. Анализируя молоко сырое как значимую точку риска, сле-

дует учитывать сложность и неоднозначность самого критерия «бактериальная обсемененность». С одной стороны, это общий суммарный уровень содержания микроорганизмов в молоке – показатель КМАФАнМ, с другой – разнообразный бактериальный пейзаж, т. е. видовой состав микрофлоры, определяющий безопасность и качество молочных продуктов .

Источник первичного обсеменения молочных продуктов микроорганизмами – молоко-сырье. Обсеменение молока сырого происходит на этапе его получения, хранения, транспортировки и зависит от здоровья животных, в том числе их вымени; санитарно-гигиенического состояния ферм (чистоты оборудования, воды, воздуха, личной гигиены персонала) и качества кормов.

Требования к молоку сырому по бактериальной обсемененности, установленные нормативными документами РФ, Таможенного союза и ЕЭС, представлены в табл. 1.

Как правило, стандартные методы микробиологических исследований достаточно трудоемки и для получения результата требуется нескольких суток.

В итоге результат продолжительного микробиологического исследования не может быть использован в производственном процессе и является формальным.

Для управления технологическими процессами в молочной промышленности необходимы количест венные экспресс-методы микробиологического конт роля, дающие результат в режиме реального времени и обеспечивающие возможность быстрой микробиологической диагностики поступающих потоков сырого молока разного качества.

Работа с поставщиками сырого молока – эффективный путь повышения безопасности всей производственной цепи. Поэтому она должна сводиться не к формальному декадному контролю, а к объективной оценке микробиологического качества молока в реальном вре мени и помощи поставщикам в устранении текущих проблем.

Под реальным временем оценки микробиологического качества молока следует понимать диапазон в несколько минут.

В этом случае быстрый количественный микробиологический результат становится ключом к инновационной системе управления современным производством, где цифровые данные немедленно поступают в информационную систему для оперативного принятия решения.

По этой причине быстрые количественные микробиологические методы находятся в зоне пристального внимания ведущих специалистов молочной индуст рии. До последнего времени о такой возможности переработчики молока могли только мечтать.

Согласно ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция.

Методы микробиологического анализа», для определения бактериальной обсемененности молока сырого в качестве арбитражного метода используется стандартный чашечный метод посева определенных разведений исходного молока на твердую питательную среду КМАФАнМ с последующим культивированием в течение 72 ч при (30±1) °С и подсчетом колоний образующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Основной недостаток чашечного метода – длительность анализа, так как большинству микроорганизмов для образования видимых колоний необходимо не менее 2–3 сут.

Точность и воспроизводимость результатов определения бактериальной обсемененности молока чашечным методом зависит от ряда причин:

• ростовых характеристик питательной среды и правильности ее приготовления;
• точности работы микробиолога при приготовлении разведений продукта и проведении посева;
• правильности подсчета колоний и обработке результатов.

Для определения уровня бактериальной обсемененности молока сырого ГОСТ 32901-2014 предполагает возможность применения косвенного экспресс-метода – редуктазной пробы.

В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду, наряду с другими окислительновосстановительными ферментами, анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами.

Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По интенсивности изменения окраски резазурина через 1 ч оценивают уровень бактериальной обсеменности сырого молока.

Основные преимущества оценки уровня бактериальной обсемененности молока по редуктазной пробе:

• метод крайне прост в исполнении и не требует специального оборудования;
• метод малозатратный, не предполагающий дорогостоящих реактивов;
• метод, проверенный многолетним опытом применения в промышленности.

Основные недостатки метода:

• низкая чувствительность (порог чувствительности составляет 3⋅105 КОЕ/см3);
• дает возможность отнести молоко к тому или иному классу (до 500 тыс. в 1 см3 молока – I класс; более 500 тыс. в 1 см3 молока – II класс) без конкретных показателей количества бактериальных клеток.

В отделе микробиологии ВНИИМС на протяжении многих лет ведутся постоянные исследования не только микрофлоры молока и молочных продуктов, но и методов их контроля.

Реально до последнего времени мы не располагали возможностью предложить промышленности приборный экспресс-метод определения бактериальной обсемененности молока, обеспечивающий надежную сходимость результатов с арбитражным методом оценки показателя КМАФАнМ, нормируемого Техническим регламентом Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и внесенного в ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа».

В 2013 г. в отделе микробиологии ВНИИМС были начаты испытания нового отечественного пробора, предназначенного для определения бактериальной обсемененности молока, – турбидофлуориметра «БиоТФ» (Государственный реестр СИ № 56270-14).

Данный метод получил условное название «биокинетический анализ динамики флуоресценции в процессе метаболизма флуорогенного субстрата микро-организмами».

Флуоресцентная технология «БиоТФ» позволяет про-водить измерение непосредственно в образце молока, отказавшись от разведений и анализируя микроорганизмы во всем объеме представительной пробы.

Результаты определения могут быть представлены как в абсолютных значениях микробной биомассы, так и со-отнесены с результатами определения колониеобразую-щих единиц (КОЕ) или численностью клеток.

Для формирования протокола исследования используют программное обеспечение «БиоТФ», которое собирает и обрабатывает данные турбидофлуориметра в соответствии с методикой выполнения измерения «Старт», формализованной в виде программного приложения.

Перед началом исследования тест-пробирку «Старт», содержащую комплекс реагентов, и образец сырого молока необходимо нагреть до температуры 20 °С. Пробу сырого молока вносят в тест-пробирку «Старт» c помощью дозатора, тщательно перемешивают и помещают в измерительную камеру турбидофлуориметра «БиоТФ» (см. фото).

Измерение начнется и закончится автоматически. Программное обеспечение «БиоТФ» рассчитает общее количество микроорганизмов в 1 см3 молока. Общее время, необходимое для проведения анализа, – 7–10 мин. Диапазон определения: от 10 000 до 2 000 000 бактериальных клеток/см3 молока. Чувствительность метода – 1 бактериальная клетка [5].

Бактериальную обсемененность в образцах молока определяли параллельно четырьмя методами: арбитражным чашечным методом на среде КМАФАнМ; чашечным методом посева на питательную среду, соответствующую по составу стандартам ЕЭС; ре-
дуктазной пробой и приборным методом с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ».

Графическая зависимость для общего массива данных, полученных при определении бактериальной обсемененности молока арбитражным методом на среде КМАФАнМ и с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ», представлена на рис. 1

Основной критерий сходимости методов – коэффициент линейного уравнения (1,025), при этом свободный членлинейного уравнения (0,0281) несет информацию о сдвиге методов. Чем ближе коэффициент к единице и чем ближе свободный член к нулю, тем выше сходимость методов.

Для оценки возможности применения экспресс-метода при входном контроле было исследовано 137 образцов молока сырого по показателю бактериальной обсемененности.

Исследования проводили стандартным чашечным методом в соответствии с ГОСТ 32901-2014 и при-
борным экспресс методом «Старт» – «БиоТФ».

На рис. 2 и 3, а также в табл. 2 представлены результаты статистической оценки методов контроля бактериальной обсемененности образцов молока, ранжированных по классам:
•• I класс – до 100 тыс. КОЕ/см3 ;
•• II класс – от 100 до 500 тыс. КОЕ/см3;
•• III класс – более 500 тыс. КОЕ/см3 .

Среднее значение десятичного логарифма численности микроорганизмов в серии экспериментов стандартным и экспресс-методом составило 4,69 и 4,81 lg КОЕ/см3, соответственно. Деление результатов, полученных в каждой серии экспериментов, на классы в соответствии с существующей системой градации качества молока выявило тождественность методов.

Данные статистической обработки результатов, представленные в табл. 2, подтверждают ранее сделанные выводы о сходимости показателей бактериальной обсемененности молока по всему диапазону значений. В каждом классе средние арифметические значения бактериальной
обсемененности, выявленные сравниваемыми методами, совпадают между собой.

Кроме того, значения медиан в каждом классе для каждого метода совпадают со средними арифметическими, что свидетельствует о нормальном распределении и правомочности сравнения данных.

Всесторонний анализ полученных результатов как пообщему массиву данных, так и по группам молока с различным уровнем бактериальной обсемененности позволяет сделать следующие выводы:
•• метод определения бактериальной обсемененности
молока с использованием турбидофлуориметра «БиоТФ» в полной мере отвечает требованиям экспрессности, так как суммарное время анализа не превышает 10 мин;
•• метод прост в применении и не требует специальной подготовки персонала;
•• метод определяет биомассу клеток в исходной пробе молока, которую затем автоматически пересчитывает в показатель КОЕ. Метод напрямую не фиксирует количество жизнеспособных клеток, которые мы затем определяем показателем КОЕ, однако максимально объективно, в сравнении с другими косвенными методами, приближается к оценке именно этого показателя;
•• значения бактериальной обсемененности молока, получаемые с помощью приборного метода, статистически достоверно совпадают с показателями арбитражного чашечного метода контроля КМАФАнМ при обсемененно-сти молока выше 100 тыс. КОЕ/см3 и несколько завыше-ны при уровне обсемененности ниже 100 тыс. КОЕ/см3.
Таким образом, мы можем реально предложить промышленности приборный экспресс-метод определения бактериальной обсемененности молока с помощью турбидофлуориметра «БиоТФ», обеспечивающий надежную сходимость результатов с арбитражным чашечным ме-тодом оценки показателя КМАФАнМ. Прибор не имеет зарубежных аналогов, что касается его стоимости, то как сам прибор, так и расходные материалы абсолютно доступны любым производителям молочных продуктов.

Получите подробную консультацию по анализатору бактериальной обсемененности молока у специалистов компании Агролаб по телефону 8 (383) 280-42-38

Источник: http://agrolab-nsk.ru/posts/1704098

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) и сальмонеллы: характеристика, санитарно-показательное значение, методы определения, нормирование в пищевых продуктах

Поиск Лекций

БГКП. К бактериям группы кишечных палочек (колиформных) относят роды Escherichia (типичный представитель E. coli), Citrobacter (типичный представитель C. colicitrovorum), Enterobacter (типичный представитель E. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности свойств.

Общая хар-ка БГКП: – палочки грамм-отрицательные, короткие; – не спорообразующие; – на среде Энда дают красные колонии с металлическим блеском – E.coli, красные – энтеробактерии, розовые – цитробактерии, б/цв – лактозо – отрицательные.Биохимические свойства.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. Устойчивость.

Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65-75°С). При 60°С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут.Санитарно-показательное значение. Бактерии рода Escherichia– постоян.

обитатели кишечника чел и животн, и обнаружение их в воде и ПП свидетельств о свежем фекальном загрязнении. Бактерии родов Citrobacter и Enterobacter могут находиться повсюду: в почве, на растениях, реже в кишечнике.

Считают, что они предст собой результат изменен ишерихий после пребывания их во внешней среде и поэтому являются показателями более давнего фекального загрязнения. Значение БГКП:

– в сыром молоке указывает – на на эпидемиологическую опасность

– через несколько часов при 8-10оС – о нарушении условий хранения и реализации, транспортиров.

– появл. БГКП после пастеризации расценивают как 2-ое загрязнение

– наличие БГКП в готовой продукции указывает на – плохую мойку и дезинфекцию оборудования.

Род Salmonella. Сальмонеллезы относятся к числу наиболее распространенных токсикоинфекций. Обнаруж сальмонелл всегда свидетельствует о фекальном загрязнении. Сальмонеллы устойчивы к высоким концентрациям поваренной соли (особенно в средах, содержащих белок) и высушиванию.

Сохраняют свою жизнеспособность в комнатной пыли, в различных почвах (97 мес.), в воде открытых водоемов (до 45 дн). Находясь в ПП, особенно в мясных, сальмонеллы очень устойчивы к тепловой обработке. Соление и копчение мяса оказывают слабое воздействие на сальмонелл.

Молоко и молочные продукты гораздо реже явл причиной пищевых отравлений. Инфицирование молока главным образом происходит через загрязненную посуду, доильные аппараты, руки доильщиц и др.

Возбудители сальмонеллезов могут попасть в ПП, изготовленные из растительного сырья (салаты и соусы столовые) не только в процессе производства, но и с пищевыми ингредиентами, в частности с сухими овощными приправами и специями.

Микробиол-й пок-ль	Санитарно-гигиенич-е значение	Колич-й критерий,	Характеристика
БГКП	Для хар-ки санитарно-эпидем. состояния пищевых продуктов и условий их изготовления	Более 103 КОЕ/г(см3)     Наличие E. coli	Низкое санит. состояние пищ-го прод-та и усл-й его изгот. Свежее фекальное загрязнение
Сальмонеллы	-//-и для хар-ки безопасности для потребителя	обнаружение в 25г продукта	Низкое санит. состояние пищ-го прод-та и усл-й его изгот., опасность продуктадля чел

Идентификация БГКП:

● Посев на среду обогащения – Кесслер, одновременная идентификация по газообразов.: есть газообразование – возможно БКГП, нет газообразования – нет БГКП

● Идентификация БГКП на среде Эндо: Из газ(+) пробирок отбирают по 1 мл и сеют на тв.среду Эндо, идентифицируют колонии БГКП по цвету, проводят дифференциацию по родам в зависимости от цвета колоний: Если есть красные, розовые и бледно-розовые культуры – значит присутствуют БГКП, если нет колоний – нет БГКП.

Если есть колонии, но бесцветные – подозрение на патогены. Далее по цвету идентифицируют роды БГКП: 1) красные – с металлич. оттенк.

– эшерихия 2) розовые – энтеробактер 3) бледно-розовые – со слизью – клебсиела 4) бледно-розовые – цитробактер, церрации 5) бесцветные (лактозо (-)) – протей 6) прозрачные мелкие – патогенны

● Идентификация на среде Козера: выращивание на среде с глюкозой/лимонной кислотой, Т=43°С,24ч. М/о цитрат(+) меняют цвет красителя с зеленого на васильковый. М/о цитрат(-) не меняют цвет.

Определяют по количеству положительных проб в 3 пробирках.

Сальмонеллы – патогенны, анализируют в 25 г продукта, их там не должно быть. Служат индикатором патогенов.

Выявление сальмонелл проводится в 4 этапа

1) первичный (прямой) посев – Посев на среду Энда и Плоскирава на сутки и Т=370С. На ср. Энда – прозрачные колонии,

2) обогащение (посев на жидкие селективные среды, термостатирование)

3) посев со среды обогащения осущ после обогащения на плотные диагностические среды, термостатирование – на ср. Плоскирава- прозрачные,но более мелкие чем на среде Эндо

4) подтверждение путем установления ферментативных и серологических свойств сальмонелл

Рекомендуемые страницы:

Источник: https://poisk-ru.ru/s30849t5.html

Определение колиформных бактерий (БГКП)

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 8Следующая ⇒

Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.

Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод.

Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде.

В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.

Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом.

Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).

Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см3, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек.

При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см3 воды; по этапам очистки – 0,1; 1; 10; 100 см3 воды).

Для фильтрования в воронку или стакан наливают необходимые объемы воды, начиная с меньших, а затем большие, каждый раз меняя фильтры. Самый меньший объем воды – 1 мл – следует фильтровать через фильтр, предварительно смоченный стерильной водой.

После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно (при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на фильтре) стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии, избегая появления пузырьков воздуха между фильтром и средой.

На одну чашку можно разместить 4 фильтра, под каждым на дне чашки следует надписать объем воды, номер пробы и число.

Если вода мутная, то фильтрование ведется сразу через два фильтра: предварительный фильтр № 6 (для задержания крупных частиц) помещают на фильтр № 2. После фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Чашки с фильтрами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. При окончательном результате учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

При наличии в воде БГКП на фильтрах появляется рост типичных для этих бактерий колоний: темно-красные с металлическим блеском или красные, розовые с красным центром, имеющие четкий отпечаток на обратной стороне фильтра. Бактерии из таких колоний окрашивают по Граму и микроскопируют.

С культурой грамотрицательных бактерий лактозополо-жительных колоний ставят оксидазный тест для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae (последние являются оксидазообразующими бактериями).

2-3 колонии, не изменившие окраску (оксидазоотрицательные) засевают в пробирку с полужидкой средой с 0,5% раствором глюкозы и инкубируют при 37°С. При появлении кислоты и газа результат считают положительным. Подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Колииндекс (индекс ОКБ, БГКП) высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см3 и делят на этот объем воды.

К • 1000

индекс = —————

V

где К- количество проверенных на принадлежность к ОКБ (БГКП) колоний на фильтрах;

V- объем профильтрованной воды через фильтры, на которых велся учет.

Пример 1. При посеве трех объемов воды по 100 см3 на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3*1000):300 = 10.

Пример 2. При посеве 10 и 100 см3 воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6*1000):110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Для перевода индекса в титр используют формулу:

В соответствии с ГОСТ, у воды питьевой индекс ОКБ должен быть не более 3, у воды плавательного бассейна – не более 10.

Метод мембранных фильтров является современным, точным, менее трудоемким и более дешевым в сравнении с титрационным методом.

Однако одним из самых существенных недостатков метода является то, что этим методом выявляется меньшее количество бактерий в сравнении с титрационным. Для большей точности рекомендуется исследование воды проводить параллельно обоими методами.

Титрационный метод исследования воды основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Объем засеваемой воды зависит от характера исследуемого объекта, но обязательно посев ведется в 2-3, а в некоторых случаях – в 5-ти повторностях.

При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100; 10; 1 и 0,1 см3 воды; на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100 см3, три объема по 10 см3 и три объема по 1 см3.

Посев воды производится в глюкозопептонную среду (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде, поплавок). Для посевов больших объемов воды используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Так, посев 100 мл воды производят в 10 мл концентрированной среды, 50 мл – в 15 мл концентрированной среды, 10 мл – в 1 мл концентрированной среды; 1 мл и последующие разведения – в 10 мл глюкозопептонной среды нормальной концентрации. Большие объемы воды засеваются во флаконы или колбы, меньшие – в пробирки.

Посевы инкубируют в термостате в течение суток при температуре 37°С.

При наличии на среде Эндо характерных для БГКП колоний (красных с металлическим блеском) следует провести все тесты, перечисленные выше.

Положительный ответ на наличие БГКП дается в том случае, если наблюдается рост характерных колоний, образованных оксидазоотрицательными, Гр(-) бактериями, сбраживающих глюкозу при 37°С с образованием кислоты и газа. Таким образом, положительный ответ выдается через 40—42 ч.

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Таблица 5. Определение индекса БГКП при исследовании 300 см3 воды.

Количество положительных результатов анализа воды из:	Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)	Коли-титр
трех флаконов по 100 см3	трех пробирок по 10 см3	трех пробирок по 1 см3	нижний	верхний
Менее 3	–	–	Более 333
0,5
0,5
0,5
0,9
Более1100	–	–	Менее 0,9

Таблица 6. Определение коли-индекса БГКП при исследовании 500 см3 воды.

Количество положительных результатов анализа воды из пяти флаконов по 100 см3	Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)	Коли-титр
нижний	верхний
Менее 2	6,0	Более 455
0,1	12,6
0,5	19,2
1,6	29,4
3,3	52,9
Более 16	8,0	–	Менее 62

Таблица 7. Определение индекса БГКП при исследовании воды по этапам очистки.

Объем исследуемой воды, см3	Коли-индекс	Коли-титр
1,0	0,1
–	–	–	–	Менее 9	Более 111
–	–	+	–
–	+	–	–
+	–	–	–
+	–	+	–
+	+	–	–
+	+	–	+
+	+	+	–	0,4
+	+	+	+	Более 2380	Менее 0,4

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ)

ТКБ определяют теми же методами, как и БГКП, кроме последнего этапа идентификации, который проводится по ферментации лактозы на полужидкой питательной среде при 44,5°С. В случае роста на среде Эндо типичных лактозоположительных колоний, Гр(-), оксидазоотрицательных, способных ферментировать лактозу при 44,5°С, их учитывают как ТКБ, индекс или титр определяют по таблице 6.

Определение колифагов.

Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют методом агаровых слоев по Грациа.

Для определения используют чувствительные музейные культуры микроорганизмов (тест-организмы): мутант Salmonella tuphimurium, непатогенный для человека, штамм Escherichia coli К-12 Hfr из соответствующей коллекции культур АТСС 23631 или NTCT12486, штамм E.coli рода CN, называемый WG5, а также бактериофаги MS2, NCTC12487 или АТСС 15597 для контроля чувствительности тест-организмов.

За 18-24 часа перед проведением анализа необходимо сделать посев тест-культуры E.coli К12 F+ на скошенный питательный агар (МПА). Перед проведением анализа сделать смыв с «косяка» 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь тест-организма в концентрации 109 бакт. клеток/мл.

Расплавить и остудить до 45°С 2%-ный питательный агар. Исследуемую воду 100 мл внести в 5 стерильных чашек Петри (по 20 мл в каждую). В питательную среду добавить смыв E.coli (из расчета 1 мл на 100 мл агара) и хорошо перемешать.

Полученной смесью залить по 30 мл сначала пустую чашку Петри (контроль), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями.

После застывания питательной среды чашки переворачивают вверх дном и ставят для инкубирования в термостат при 37°С на 18-24 ч.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий.

Испытуемую воду вносят в расплавленную и остуженную среду Вильсона—Блера. Среда содержит тиосульфат (гипосульфит) и бесцветную соль железа. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, который придает среде черный цвет.

Количественно эти микроорганизмы в воде можно определить методом мембранной фильтрации или прямым посевом.

Перед посевом пробу воды прогревают на водяной бане при температуре 75±5°С в течение 15 мин для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды, ее можно не прогревать.

Применяя метод мембранной фильтрации, пробу воды определенного объема пропускают через фильтр, который затем помещается в пробирку с подготовленной расплавленной питательной средой верхней стороной внутрь (пробирка с питательной средой после посева должна быть немедленно охлаждена в холодной воде во избежание попадания воздуха) или в чашку Петри на поверхность питательной среды, которая затем заливается той же питательной средой толстым слоем.

Метод прямого посева предполагает посев в стерильные пробирки 20 мл воды следующим образом: по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл), или по 5 мл в 4 пробирки (объемом не менее 15 мл).

Сверху посевы воды заливают горячим (75-80°С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Пробирки с посевами быстро охлаждают в стакане с холодной водой, инкубируют при 44°С в течение 24 ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтре, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфит-редуцирующих клостридий в определенном объеме воды (подвергнутой анализу).

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Рекомендуемые страницы:

Источник: https://lektsia.com/3×2585.html

Законодательная база Российской Федерации

• Главная
• “МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПОЧВЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ” (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24.12.2004 N ФЦ/4022)

7. Определение общих колиформных бактерий (БГКП)

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель “бактерии группы кишечных палочек” (БГКП) приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю “общие колиформные бактерии”. К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при t (35 – 37 °C) с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 – 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор.

Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.

При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом. В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведения суспензии на поверхность среды Эндо.

Титрационный метод определения индекса БГКП (колиформ) в почве

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 куб. см, засевают во флаконы с 90,0 куб. см жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) или среды Кесслера, что соответствует засеву 1 г почвы. Соотношение между навеской почвы или ее эквивалентным разведением и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации – 1:1.

Посев меньших количеств (0,01 г, 0,001 г, то есть 10(2), 10(3) и т.д.) делают по 1,0 куб. см из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9,0 куб. см тех же сред. Титрование проводят до разведения 1:1000000, то есть 10(6) с регулярной сменой пипеток при переходе от одного разведения к другому. Посевы инкубируют в течение 48 ч при (37 +/- 1) °C, через (24 +/- 2) ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Отсутствие газообразования и помутнения через 48 ч инкубации выдают окончательный отрицательный ответ.

При наличии в посевах признаков роста: помутнения и газообразования или только помутнения – производится высев на поверхность среды Эндо.

Чашки с посевами помещают в термостат на (18 – 24) ч при температуре (37 +/- 1) °C. При отсутствии роста на чашках выдают отрицательный ответ. При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний, малиновых с металлическим блеском или без него проводят микроскопию колоний с последующей постановкой оксидазного теста. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий рода Pseudomonoas и других видов сапрофитных бактерий. Микроскопирование и постановка оксидазного теста проводится по МУК 4.2.1018-01.

Определение БГКП в почве методом мембранной фильтрации

В качестве ускоренного метода для обнаружения колиформных бактерий целесообразно использовать метод мембранных фильтров.

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Метод основан на фильтрации установленного объема – 5,0 – 10,0 куб. см почвенной суспензии первого разведения (1:10) – через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной, питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Для того чтобы облегчить фильтрование почвенной суспензии через мембранный фильтр, желательно до фильтрования провести предварительную обработку.

Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

Подготовка фильтровального аппарата

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум.

Следует начинать с фильтрования проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо с добавлением розоловой кислоты, разлитую в стерильные чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Эта среда используется только при работе методом мембранной фильтрации. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 – 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие БГКП в исследуемой почве.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к БГКП.

Для подтверждения наличия БГКП исследуют:

– все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

– не менее 3 – 4 колоний каждого типа.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

– наличие оксидазной активности;

– принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

– ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Для расчета индекса количества бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме почвы, умножают на 1000 и делят на этот объем.

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета БГКП в почве

При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 куб. см на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведении от 1:10 до 1:1000, то есть от 10(1) до 10(3). При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10(6). Посевы выращивают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.

• Главная
• “МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПОЧВЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ” (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24.12.2004 N ФЦ/4022)

Источник: https://zakonbase.ru/content/part/558823