Методы и прикладное значение исследования генома бактерий

Доклад Современные методы идентификации микроорганизмов студентка 1 курса магистратуры

Методы и прикладное значение исследования генома бактерий

страница 1

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Базовая кафедра биотехнологии

Доклад
Современные методы идентификации микроорганизмов.

Выполнила: студентка 1 курса магистратуры

Гр. ББ1201Б

Ларионова М.Д.

Проверила: Литовка Ю.А.

Красноярск 2012

В настоящее время учеными описано несколько тысяч видов организмов, однако считается, что это составляет менее 1% от реально существующих.

Цель идентификации – установить таксономическое положение исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и принятыми (официально зарегистрированными) видами.

Принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и эукариот имеют существенные различия.

Идентификация дрожжевых грибов, которые относятся к числу широко используемых объектов разных микробиологических исследований, основана на культуральных, морфологических, цитологических, физиолого-биохимических особенностях, характеристике жизненных циклов и полового процесса.

Идентификация прокариот, которые морфологически менее разнообразны, чем эукариоты, основана на использовании широкого спектра фенотипических и генотипических признаков. Она в большей степени, чем идентификация эукариот, основывается на функциональных признаках, поскольку большинство бактерий можно идентифицировать не по внешнему виду и по процессам, которые они способны осуществлять.

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина в ДНК, последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем синтез 16S рРНК и другие фено- и генотипические признаки.

Обратите внимание

Культуральные свойства, т.е. характерные особенности роста бактерий на плотных и жидких питательных средах обычно используют для их характеристики, однако для идентификации применяют довольно редко.

Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию.

Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем и органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуолей и т.д.), присущих отдельным группам бактерий, а также включений (параспоральных телец, гранул волютина, полигид-роксибутирата, полисахаридов и т.д.).

Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок.

Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего установление способа питания исследуемой бактерии (фото / хемо-, авто / гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фотосинтезу).

Важно определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим факторам среды.

В данную группу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого используют специальные тесты.

Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных признаков, важны для диагностики и широко используются в медицинской микробиологии. Их постановка требует значительных затрат времени, большого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стандартных условий проведения.

Для ускорения и облегчения процесса идентификации некоторых микроорганизмов, имеющих главным образом медицинское значение, разработаны различные тест-системы.

Важно

Например, система Enterotube, предназначенная для идентификации энтеробактерий, представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды.

О положительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование), или после введения специальных реактивов. Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

Определение химического состава клеток бактерий также имеет значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические методы могут быть важными, для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетворительной идентификации.

В состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов уникальных гетерополимеров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. В качестве хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Состав клеточной стенки определяет и серологические свойства бактерий.

Это лежит в основе иммунохимических методов их идентификации.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление – белковая таксономия.

Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия.

Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.

Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической (или адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи французского ботаника М. Адансона (М.

Совет

Adanson), предложившего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных.

Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки не менее 100 фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты могли обозначаться знаками «минус» или «плюс».

Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства.

S = (a+b) / a+b+c+d,

Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 – полное несходство. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и / или в виде дендрограммы.

Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства.

Особой проблемой является идентификация таких бактерий и архей, особенно морских видов, которые не способны расти на известных лабораторных питательных средах, и для которых нельзя было получить чистую культуру. До недавнего времени эта проблема казалась неразрешимой.

Однако около 15 лет назад были разработаны методы, позволившие экстрагировать, клонировать, секвенировать и сравнивать рРНК прямо из окружающей среды. Это позволило точно сосчитать и идентифицировать микроорганизмы, населяющий данный биотоп без их выделения в чистую культуру.

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.

Обратите внимание

Филогенетические взаимоотношения бактерий оценивают определением молярного содержания ГЦ в ДНК, методами ДНК-ДНК и ДНК-рРНК гибридизации, с помощью ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 5S, 16S и 23S рРНК.

Определение молярного содержания ГЦ от общего количества оснований ДНК у прокариот колеблется от 25 до 75%. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным содержанием ГЦ. Однако если два организма очень близки по нуклеотидному составу, то это может являться свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они обладают большим числом фенотипических признаков.

Гибридизация. Методы гибридизации ДНК состоят в смешивании одноцепочечных фрагментов ДНК, полученных от двух разных видов. Доля в смеси общей ДНК, которая воссоединяется, образуя двухцепочечные спирали, и скорость воссоединения служат мерами степени генетического родства между данными видами. Этот метод широко применяется зоологами, ботаниками и другими исследователями.

Метод ДНК-ДНК-гибридизации является более важным для оценки генетического родства бактерий. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает 70-100%.

Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательностей нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК-ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению.

В таком случае гибридизация ДНК-рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК-рРНК-гибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК-ДНК не выявляет заметной гомологии.

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов – разновидность метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК.

Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим генетический маркер (ген), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии.

Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии, затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК.

Важно

Далее выбранный фрагмент ДНК сшивают с подходящей плазмидой, и полученную рекомбинантную плазмиду вводят в удобный штамм бактерий (например, в E.coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию генетического зонда с ДНК бактерии.

Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом.

Для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации наиболее широкое распространение и значение получил метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности.

Считается, что они находятся вне механизма естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. В случае анализа 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120 нуклеотидов.

При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих молекул при помощи специфических рестриктаз.

При выполнении данных методик исследований необходимо проведения ряда последовательных операций.

Первая – разрушение клеток, выделение нуклеиновых кислот и при необходимости их дополнительная очистка с помощью соответствующих наборов реактивов. Следующая – амплификация исследуемых участков в выделенной смеси НК для увеличения концентрации этих фрагментов с применением соответствующих праймеров в ПЦР-реакции. Полученные ПЦР-продукты – концентрированная смесь амплифицированных участков, принадлежащим различным бактериям, разделяют, например методом ДГГЭ (Денатурирующего градиентного гель-электрофореза). Если на этой стадии ввести соответствующие контроли, томожно провести предварительную идентификацию бактерий. Однако для достоверной идентификации нужно производить изъятие отдельных полос их электрофореграммы геля для последующего секвенирования. Выявленные последовательности сравнивают с данными, имеющимися в международном банке генов, после чего составляют списки выявленных организмов и строят филогенетические схемы микробного сообщества.

Читайте также:  Как выглядят под микроскопом различные бактерии

В настоящее время также разработаны иммунофлуоресцентные методы (ИФМ), позволяющие выявить интересующий исследователя организм без выделения в чистую культуру. В основе любых модификаций ИФМ используется взаимодействие антиген-антитело, которое соединено с флуоресцирующим красителем. Специфичность реакции антиген-антитело высока, поэтому и вероятность выявления микроорганизма в природных образцах или накопительных культурах тоже высока. Недостатком являются относительно долгая процедура приготовления сывороток с красителями и существование перекрестных реакций.

Совет

Недостатков ИФМ лишен метод, основанный на взаимодействии флоуресцентно окрашенных олигонуклеотидов с соответствующими участками 16S рРНК целых клеток (метод FISH – Fluorescent in situ hybridization).

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды, которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

В настоящее время с помощью молекулярно-генетических методов идентификация бактерий стала менее трудоемким процессом, зачастую не требующим выделения бактерий в чистую клеточную культуру. Благодаря этому современные квалифицированные специалисты – медики, микробиологи, эпидемиологи – теперь способны проводить микробиологические исследования в считанные часы.

Источник: http://vmest.ru/nuda/doklad-sovremennie-metodi-identifikacii-mikroorganizmov-studen/main.html

Генетика бактерий

Генетика (от греч. genos — рождение) — это наука, изучающая наследственность и изменчивость. Микроорганизмы обладают способностью изменять свои основные признаки:

морфологические (строение); культуральные (рост на питательных средах); биохимические или ферментативные признаки (добавление определенных веществ в питательную среду может вызвать активацию фермента, который до этого находится в латентном состоянии); биологические свойства — может меняться степень па-тогенности, на этом основаны способы приготовления живых вакцин.

Например, при 12—14-дневном культивировании возбудителя сибирской язвы при t° — 42—43°С микробы потеряли способность вызывать заболевание у животных, но сохранили свои иммуногенные свойства.

БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) снизила болезнетвор-ность бычьего вида микобактерий туберкулеза путем длительных пассажей на картофельной среде с желчью и глицерином при t° 38°C. Пересевы через каждые 14 дней получили ослабленный штамм микобактерий туберкулеза, который назван «вакциной» БЦЖ, используемой для профилактики туберкулеза.

Наследственность — это способность организмов сохранять определенные признаки на протяжении многих поколений.

Изменчивость — это приобретение признаков под влиянием различных факторов, отличающих их от предыдущих поколений.

Генетическая информация в клетках бактерий заключена в ДНК (у некоторых вирусов РНК). Молекула ДНК состоит из двух нитей, каждая из которых спирально закручена относительно другой. При делении клетки спираль удваивается.

Обратите внимание

И вновь образуется двунитчатая молекула ДНК. В состав молекулы ДНК входят 4 азотистых основания — одекаин, гуанин, цитозин, тимин.

Порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их наследственную информацию, закодированную в ДНК.

Формы проявления изменчивости

Ненаследственная, фенотипическая изменчивость, или модификация, микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные условия ее существования.

Эта адаптивная реакция на внешние раздражители не сопровождается изменением генотипа и поэтому не передается по наследству.

Могут измениться морфология (удлиняется), культуральные свойства (стафилококки без пигмента при недостатке кислорода) биохимические или ферментативные свойства, вырабатываются адаптивные ферменты Е. coli, фермент лактаза на среде — с лактозой.

2. Наследуемая генетическая изменчивость возникает в результате мутаций и генетических рекомбинаций. Изменчивость микроорганизмов

Фенотипическая изменчивость (ненаследуемая модификация)

Генотипическая изменчивость наследуемая

Мутации (от лат. mutatio — изменять) — это передаваемые по наследству структурные изменения генов. При мутациях изменяются участки геномов (т. е. наследственного аппарата).

Бактериальные мутации могут быть спонтанными (самопроизвольными) и индуцированными (направленными), т. е. появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (хим. веществами, температурой, излучением и т.д.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться:

* изменение морфологических свойств; изменение культуральных свойств; возникновение у микроорганизмов устойчивости к лекарственным препаратам;

* ослабление болезнетворных свойств и др.

Важно

К генетическим рекомбинациям относятся рекомбинации генов, которые происходят вследствие трансформации, от донора трансдукции и конъюгации.

Трансформация — передача генетического материала реципиенту при помощи изолированной ДНК другой клетки. Клетки, способные воспринимать ДНК другой клетки, называются компетентными.

Состояние компетентности часто совпадает с логарифмической фазой роста. Для трансформации необходимо создавать особые условия, например, добавляя неорганические фосфаты, повышается частота трансформации.

Трансдукция — это перенос наследственного материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту, который осуществляет фаг. Например, с помощью фага можно воспроизвести трансдукцию жгутиков, ферментативные свойства, ре-зистентность к антибиотикам, токсигенность и другие признаки.

Конъюгация бактерий — передача генетического материала от одной клетки другой путем непосредственного контакта. Причем происходит односторонний перенос генетического материала — от донора реципиенту.

Необходимым условием для конъюгации является наличие у донора специфического фактора плодовитости F. У граммотрицательных бактерий обнаружены половые F-волоски, через них происходит перенос генетического материала.

Клетки, играющие роль донора, обозначают F+, а реципиенты — F.

F-фактор находится в цитоплазме клеток, причем он не один. При конъюгации происходит перенос только ДНК без РНК и белка.

Практическое значение изменчивости: с помощью генетических методов получены специальные культуры дрожжей и других микробов, используемые в технологии изготовления пищевых продуктов, производстве анатоксинов, вакцин, антибиотиков, витаминов;

* большое научное и практическое значение имеет генная инженерия, методы которой позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ, которые получить химическим путем очень трудно, — инсулин, интерферон и др.;

* при использовании мутагенных факторов (УФ-лучей, рентгеновские лучи, у-лучи, диэтилсульфат и др.) были получены мутанты — продуценты антибиотиков, которые в 100—1000 раз активнее исходных.

Источник: http://mikrobiki.ru/mikrobiologiya/osnovy-mikrobiologii-i-immunologii/genetika-bakterii.html

Геномика патогенных бактерий и вирусов

Геномика микроорганизмов имеет прямое отношение к клинической медицине. Закономерности геномной организации патогенных бактерий и вирусов позволяют более точно понять природу инфекционного процесса, определить направление создания вакцин, уточнить патогенные мишени микроорганизмов для создания лекарств.

Секвенирование генома бактерий началось в конце 80-х годов XX века, когда уже были созданы методические предпосылки. Первым секвенированным бактериальным геномом был геном Mycoplasma genitalium (1995).

За последние годы список полностью секвенированных геномов бактерий увеличился до 20 видов, среди которых представители таких родов патогенных бактерий, как Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacferium, Yersinia и др.

Совет

Как показали геномные исследования, патогенные бактерии весьма разнообразны по комбинаторике генов, определяющих патогенность. У них имеются специфические гены, контролирующие синтез факторов вирулентнтности (адгезины, инвазины, порины, токсины, гемолизины).

Большинство таких генов собрано в кластеры («островки патогенности»). Они могут быть локализованы в хромосоме бактерии или в плазмидах.

Патогенные бактерии, геномы которых секвенированы

Бактерия (штамм) Болезнь Размер генома, пар нуклеотидов
Mycoplasma pneumoniae Пневмония 816
Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) Туберкулёз 4411
Neisseria meningitidis (MC58) Менингит 2272
Vibrio cholerae (El-Tor 16961) Холера 4033
Helicobacter pylori (26695) Гастрит, язвенная болезнь 1667
Treponema pallidum (Nichols) Сифилис 1138
Chlamidia trachomatis Трахома 106
Hemophilus influenzae (Rd) Отиты, ОРЗ 1830

«Островки патогенности» участвуют в геномных перестройках, что и определяет приспособляемость и широкую внутривидовую вариабельность бактерий.

Поскольку геномы бактерий небольшие (от 100 000 до 4 млн пар нуклеотидов), многое удалось уже сделать в области функциональной геномики. И структурные, и функциональные исследования геномов патогенных бактерий показывают их высокую пластичность.

Эти представления имеют непосредственное практическое значение, во-первых, для разработки экспресс-методов типирования бактерий и оценки риска бактериальной контаминации; во-вторых, для создания лекарств, нацеленных на специфические мишени, блокирующие работу генов патогенности; в-третьих, для более целенаправленного создания вакцин.

Что касается геномики вирусов, то для большинства патогенных для человека вирусов (возбудителей вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции и СПИДа, герпесвирусных инфекций, натуральной оспы, гриппа и др.

) уже известна первичная нуклеотидная последовательность полноразмерного генома (структурная геномика).

Более того, накоплено много данных по функциональной геномике (роль отдельных фрагментов в формировании вторичной структуры генома, в образовании белков вирионов, в репликации и сборке вирионов).

Именно геномные исследования вирусов позволили объяснить их высокую пластичность (способность к рекомбинации, наличие гипервариабельных областей). Многие вирусы формируют длительную персистентную инфекцию, в результате которой происходит селекция новых вариантов вируса с изменённой первичной последовательностью, а следовательно, с изменёнными патогенными и антигенными свойствами.

Несмотря на интенсивные поиски участков в геномах вирусов (сайтов), ответственных за патогенные свойства вирусов, они до сих пор не обнаружены, т.е.

функциональная геномика вирусов ещё не достигла такого уровня, как структурная.

Результаты исследований позволяют с большой вероятностью думать о том, что патогенные свойства вирусов являются полифункциональным признаком, детерминируемым многими сайтами генома.

Обратите внимание

Практическое приложение сведений о нуклеотидной последовательности геномов многих патогенных вирусов уже широко реализуется. Генно-инженерным путём создаются непатогенные фрагменты геномов вирусов в составе плазмидных векторов.

Такие векторы с вирусом способны к экспрессии в высоких концентрациях белков вирусов, которые необходимы для приготовления диагностических и вакцинных препаратов. Развивается технология получения ДНК-вакцин против СПИДа, гепатита С и других вирусных инфекций.

Создана эффективная рекомбинантная вакцина против гепатита В.

Как и в геномике патогенных бактерий, сведения о функциональных свойствах отдельных участков геномов вирусов служат основой для молекулярного дизайна лекарственных средств, эффективно подавляющих размножение вируса в клетке.

Источник: https://www.eurolab.ua/encyclopedia/505/4275/

ТЕМА: ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Наследственность. Организация генетического аппарата у бактерий (нуклеоид, плазмиды, IS-последовательности, транспозоны).

2. Принципы функционирования бактериального генома. Организация оперона. Генотип и фенотип.

3. Плазмиды, классификация, структура и свойства плазмид. R-плазмида, особенности структуры и функции. Плазмиды бактериоциногении.

4. Изменчивость микробов. Модификации у бактерий, значение, основные проявления и свойства (ненаследственный характер, адаптивность, высокая частота прямых и обратных изменений, множество индуцирующих факторов).

5. Генотипическая изменчивость. Мутации и их классификация. Мутагены. Фенотипические проявления мутаций. Судьба мутантов. Диссоциация у бактерий. Влияние отбора. Система репарации повреждений генома.

6. Рекомбинационная изменчивость. Механизмы образования комбинированных геномов. Частота изменений отдельных признаков. Трансформация, трансдукция, конъюгация.

7. Практическое значение знаний о генетике микробов. Принципы генетического картирования.

Важно

8. Методы генетического анализа (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция ПЦР, секвенирование).

Читайте также:  Предотвратить рост раковых клеток можно с помощью бактерий

9. Понятие о генной инженерии и использование ее методов в микробиологии и биотехнологии. Получение и применение генно-инженерных вакцин и цитокинов.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1► Исследование H- и О- модификаций Proteus vulgaris на МПА с фенолом и без него.

Модификационная изменчивость культуральных свойств штамма Proteus vulgaris.

Чашки с МПА (одна с фенолом, другая без фенола) засеваются штриховым методом культурой Proteus vulgaris. Учет результатов проводится через сутки после посева.

МПА без фенола МПА с фенолом

Н-форма О-форма

Вывод: ______________________________________________________________________________________

2►Изучение и описание S- и R- форм колоний энтеробактерий на пластинчатом МПА.

Сравните культуральные свойства энтеробактерий в S- и R- форме:

S-колония ___________________________________________________________________________________

R- колония ___________________________________________________________________________________

3► Выявление ауксотрофных мутантов методом отпечатков (реплик).

Взвесь бактерий обрабатывают мутагеном (УФО) и разведения засевают на чашки с МПА. После инкубации выросшие колонии переносят с помощью репликатора на чашки с МПА и минимальным агаром.

После инкубации в термостате производят сравнение роста колоний на обычном и минимальном агаре. Отсутствие роста колоний на минимальном агаре соответствует расположению колоний ауксотрофных мутантов на полноценном МПА.

На рисунке обведите красным карандашом колонии ауксотрофных мутантов.

МПА Минимальный агар

Вывод: ______________________________________________________________________________________

4►Изучение роста лактозоположительных и лактозоотрицательных колоний E.coli на среде Эндо.

Укажите формы изменчивости ___________________________________________________________________

5►Учет опытов по трансформации, трансдукции, конъюгации.

Трансформация______________________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Опыт по трансформации:

Материал исследования Донор (указать генотип) ______________________________________________ Реципиент (указать генотип) __________________________________________ Среда без триптофана  
Ход исследования Приготовить смыв реципиентной культуры. Смыв внести в две пробирки. В пробирку №1 добавить физраствор (контроль). В пробирку №2 внести ДНК, выделенную из культуры донора. Инкубация в термостате. Пересев из обеих пробирок на среду без триптофана.
Учет опыта   Рекомбинат (указать генотип) _________________________________________  

Трансдукция _________________________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Опыт по трансдукции:

Материал исследования Донор (указать генотип) ______________________________________________ ___________________________________________________________________ Реципиент (указать генотип) __________________________________________ Среда Эндо  
Ход исследования Приготовить смыв реципиентной культуры (E.coli). Смыв внести в две пробирки. В пробирку №1 добавить физраствор (контроль). В пробирку №2 внести фаголизат из культуры донора. Инкубация в термостате. Пересев из обеих пробирок на среду Эндо.
Учет опыта (сделать рисунок)   Рекомбинат (указать генотип) _________________________________________  

Конъюгация__________________________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Опыт по конъюгации:

Материал исследования Донор (указать генотип) ______________________________________________ Реципиент (указать генотип) __________________________________________ Среда без триптофана и лейцина  
Ход исследования Приготовить смыв реципиентной культуры. Смыв внести в две пробирки. В пробирку №1 добавить физраствор (контроль). В пробирку №2 внести смыв культуры донора. Инкубация в термостате. Пересев из обеих пробирок на среду без триптофана и лейцина
Учет опыта Рекомбинат (указать генотип) _________________________________________  

6► Определение бактериоциногенности культур микроорганизмов.

Бактериоцины _________________________________________________________________________________

Бактериоциногенность __________________________________________________________________________

Бактериоциногенотипирование ___________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Бактериоцинотипирование ______________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Принцип метода для определения бактериоциногенности: исследуемые культуры бактерий засевают уколом в чашку с МПА. Выросшие культуры убивают парами хлороформа. После испарения хлороформа поверхность агара заливается расплавленным и остуженным 0,7% МПА, смешанным с индикаторной культурой.

Учет результатов проводится через сутки после посева по зонам подавления роста индикаторной культуры вокруг колоний, обладающих бактериоциногенностью.

Обратите внимание

Вывод:_______________________________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Совет

_____________________________________________________________________________________________

Источник: https://stydopedia.ru/3xa3f3.html

Практическое значение результатов секвенирования генома человека

27 Декабря в 19:53 3693 С результатами секвенирования генома человека связаны надежды на возможность лечения генетических заболеваний.

К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др.

Структуры этих генов расшифрованы, и сами они клонированы. Это позволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение. Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического заболевания теперь может осуществляться для постоянно растущего числа генов. При этом типичным подходом является использование исследований при помощи гибридизации или ПЦР-анализа.

Можно протестировать здорового человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и определить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучного сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя являются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, рисковать ли им, чтобы иметь детей.

В любом случае раннее начало профилактического лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или отодвинуть начало его проявления. В настоящее время в практику медико-генетического консультирования введены десятки систем для генодиагностики наиболее распространенных наследственных заболеваний.

Установленная последовательность генома поможет идентифицировать новые гены и выявить среди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям.

Как было отмечено ранее, в ходе выполнения проекта «Геном человека» были установлены последовательности целого ряда организмов – бактерий, среди которых немало патогенных, дрожжей, круглого червя Caenorhabolits elegans (нематоды), дрозофилы, мухи, москита, мыши, крысы, собаки, шимпанзе, рыбы-собаки и растений – арабидопсиса, тополя и двух видов риса.

Полученная информация (большую часть которой еще предстоит осмыслить) открыла новые возможности для развития сравнительной геномики. Оказалось, к примеру, что из 269 генов человека, мутации которых приводят к болезням, 177 генов имели родственные гены в геноме дрозофилы.

Важно

Сравнение мышиного генома с человеческим показало, что около 200 геномных блоков у человека и мыши содержат одинаковые гены (хотя и в разных хромосомах). Количество генов у нематоды только в 4-5 раз меньше, чем у человека, и часть из них также являются общими.

Это позволяет изучать функции новых генов человека и последствия мутаций известных генов, прослеживая изменение свойств организма в опытах с экспериментальными животными и экстраполируя полученные результаты на человека. В процессе прочтения генома был выявлен еще один механизм генетического разнообразия, так называемый однонуклеотидный полиморфизм (фактор СНП, по английской транскрипции).

СНП – это изменение «буквы» генетического кода без «последствий для здоровья». Считается, что у человека СНП встречается с частотой 0,1 %, т.е. каждый человек отличается от других одним нуклеотидом на каждую тысячу нуклеотидов. У шимпанзе, представляющей собой более древний вид и к тому же гораздо более гетерогенный, число СНП при сравнении двух разных особей достигает 0,4 %.

Но если различия в СНП не сказываются на здоровье особей, то чем они интересны и важны? Оказалось, что практическое значение СНП велико. Известно, что самые распространенные лекарства эффективны не более чем для четверти нуждающегося населения. Минимальные генетические отличия, обусловленные СНП, определяют эффективность лекарств и их переносимость в каждом конкретном случае.

Например, в одном из генов, кодирующих синтез рецептора адреналина, выявлено 13 СНП, которые могут комбинироваться друг с другом, давая 8 192 различных варианта (гаплотипа). Среди астматиков довольно популярно лекарство албутерол, которое взаимодействует с указанным рецептором адреналина и подавляет приступ удушья. Однако из-за разнообразия гаплотипов людей лекарство действует не на всех, а некоторым больным оно вообще противопоказано. Это обусловлено СНП: люди с последовательностью букв в одном из генов ТЦТЦЦ (Т – тимин, Ц – цитозин) не реагируют на албутерол, если же концевой цитозин заменен на гуанин (ТЦТЦГ), то реакция есть, но частичная. Для людей же с тимином вместо концевого цитозина в этом участке – ТЦТЦТ – лекарство токсично! Необходимо отметить, что развитие и достижения геномики человека, в свою очередь, обеспечили новые возможности для развития целого ряда других научных направлений (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Связь геномики человека с другими научными направлениями

Определение нуклеотидной последовательности человека является событием исторического масштаба, но между тем необходимо знать не только порядок следования звеньев в цепи ДНК и не только взаимное расположение генов и их функции. Важно выяснить характер связей между ними, который определяет, как гены будут работать в конкретных условиях – внешних и внутренних: ведь многие болезни человека обусловлены не дефектами в самих генах, а нарушениями их согласованных действий, системы их регуляции. Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

  • Роль биотехнологии в современном мире Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности, базируясь на использовании каталитического потенциала биологических агентов и систем различной степени организации и сложности – микроорганизмов, вирус… Проблемы и методы биотехнологии
  • Трансгенные животные: технологии получения В отличие от растений, где существует возможность получения целого фертильного растения из одной трансформированной соматической клетки и вегетативное размножение, получение трансгенных животных – очень сложный и длительный процесс. Проблемы и методы биотехнологии
  • Клональное микроразмножение растений В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При веге… Проблемы и методы биотехнологии
  • Примеры биотехнологических процессов Исторически наиболее ранними и широко распространёнными способами биотехнологии являются бродильные процессы. В качестве примера брожения можно привести схему процесса производства хлеба. Аналогом приготовления среды здесь является получение опары (суспензии муки в воде), в которую добавляют… Проблемы и методы биотехнологии
  • Новейшие достижения в области биотехнологии Несмотря на то что в настоящее время препараты и продукты, получаемые в процессах промышленной («белой») биотехнологии, главенствуют на рынке биотехнологических продуктов, наиболее впечатляющие успехи и прорывы в этой области связаны с использованием достижений клеточной и генетической инжен… Проблемы и методы биотехнологии

Источник: https://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/prakticheskoe-znachenie-rezultatov-sekvenirovaniya-genoma-cheloveka/

Генетика бактерий

тема: Генетика бактерий1865 год Мендель установил существование генов. 1869 Фишер выделил ДНК. Через 80 лет доказано что носителем генов является ДНК, 1953 Крик, Уотсон – расшифрована структура ДНК.

Ген выполняет следующие основные функции:

  1. Непрерывность наследования генетической информации благодаря механизму репликации ДНК
  2. Управление структурами и функциями организма с помощью генетического кода
  3. Благодаря мутации и генетическим рекомбинациям, которые происходят в гене осуществляется эволюция всех живых организмов.

Генетический код расшифрован и характеризуется следующими свойствами:

  1. Код триплетный → кодон состоит из 3 букв и кодируют одну аминокислоту
  2. Код не перекрывающийся
  3. Число бессмысленных кодонов очень маленькое (3 из 64)
  4. Последовательность расположения кодов в гене определяет последовательность положения аминокислотных остатков в полипептидной цепи
  5. Код универсален

Генетическая система обладает уникальными свойствами:

    1. Способность к самоудвоению с помощью механизма саморепликации
    2. Самовыражение (экспрессия) с помощью регулируемого синтеза матричной РНК
    3. Самообновление с помощью мутаций, рекомбинаций и самоподвижных элементов
    4. Самоисправляемая (ревизия, репарация, супрессия)
Читайте также:  Сложности идентификации бактерий в современной микробиологии

Ген – структура определяющая последовательность аминокислот в ППЦ.Гены вирусов и эукариотов состоят из экзона (кодирующий) и интроны (не кодирующие). У вирусов в одном и том же фрагменте могут существовать 2 гена с разными рамками считывания. Ген не всегда строго ограниченный участок хромосомы, есть подвижные участки у бактерий. Ген требует регулирования (регуляторы, промотеры). Ген единственные носитель и хранитель жизни, а белок определяет форму и способ жизни.Эволюция генетической системы шла в направлении кодон(триплет) → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосома прокариотов → хромосома эукариотов (ядро).Объем генома у представителей различных живых организмов сильно отличается. Можно измерить в следующих единицах: молекулярная масса нуклеиновых кислот либо в количестве нуклеотидных пар либо в количестве генов. Все эти значения сопоставимы ген в среднем включает 1000 пар нуклеотидов (вируса гепатита В – 4 гена; ВИЧ – 9 генов)Генотип – вся совокупность генов у данного вида организма. 10%-70% не кодирующие гены (повторяющиеся последовательности), они не относятся к генотипу и составляют геном.Фенотип – внешние проявления генотипа в конкретных условиях внешней среды при изменении внешних условий меняется генотип, но генотип при этом сохраняется.

^

Хромосомы бактерий располагаются свободно в цитоплазме, не ограничены мембранами, но во всех случаях ДНК бактерии связана с рецепторами на мембране. Бактерии гаплоидны, содержание ДНК не постоянно, может достигать 2, 4, 6, 8 – хромосом (у других организмов оно постоянно и удваивается только перед делением).

Передача генетической информации идет не только по вертикале (материнская→дочерняя), но и по горизонтали (конъюгация, трансформация)Помимо хромосомного генома имеется не хромосомный генетический материал, который называется плазмидным геномом (эписомы, внехромосомные факторы наследственности).

Это наделяет клетку дополнительными биологическими свойствами.

Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста или от времени клеточного цикла бактерии, которые осуществляется каждые 20-30 минут, поэтому и количество может соответствовать (4,6,8) и это сопровождается увеличением количества рибосом (этапы транскрипции, трансляции идут одновременно, возможность регулировать скорость размножения главное условие сохранения вида.

^

Вегетативная репликация: обуславливает передачу информации по вертикали, контролируется хромосомными и плазмидными генами.

Конъюгативная репликации: перенос материала по горизонтали и контролируется только плазмидными генами, при этом происходит достройка нити ДНК комплиментарной нити от донора к реципиенту.

Совет

Репаративная репликация: механизм при котором устраняется из ДНК поврежденный участокСтркуктурно-функциональной едициней является оперон – группа структурных генов связанных с особым геном оператором, он управляет всей группой структурных генов и идет как самостоятельная единица, находится под контролем гена модулятора. В хромосоме гены распределяется друг за другом контролируя разные процессы, но законченный результат можно получить выбирая не последовательно (как игра на пианино).

^

Х ромосомы бактерий имеют кольцевую форму, гены располагаются линейно, их можно последовательно расположить. Локализация генов определяют в минутах их переноса, и хромосомная карта это 0-100 минут. Определение локализации гена на хромосоме называется картированием, а их расположение хромосомной картой масштаб которой в минутах. В настоящее время есть карты: кишечной палочки.

^

Проводится с помощью ферментов – рестриктаз способные расщепить ДНК в специфических участках, которые они комплиментарны. В настоящее время известно более 100 рестриктаз. С помощью них можно получить рестрикционные фрагменты ДНК → рестрикционный анализ.

Сравнение рестрикционных фрагментов и называется рестрикционным анализом, который может быть использован для идентификации. Делают копии цепей ДНК, которые имеют липкие концы с помощью которых фрагменты вновь могут образовывать кольца. Именно за счет липких концов можно получать между разными фрагментами ДНК – рекомбинантные ДНК.

Если эти фрагменты получены с помощью одной рестриктазы они могут вступать во взаимодействия между собой.Метод клонирования. Выделенный фрагмент ДНК с помощью рекомбинантных молекул вводится в самореплицирующую генетическую структуру – в плазмиду, вирус и дальше они выполняют роль вектора для клонирования.

Их сшивают с фрагментом ДНК – геномом, который будет размножаться в составе плазмилы или в составе геном бактериальной клетки. Такие гибридные ДНК также можно выделить из клетки за счет рестрикции – вырезания. С помощью клонирования можно получать большое количество копий любого фрагмента ДНК, который можно метить радиоактивной меткой.Метод сегвинирования.

Используют для определения последовательности расположение ДНК в клонируемом фрагменте ДНК. Методы секвинирования и клонирования это методы помогающие изучить геномы в т. ч. геном человека (2004).

^

Плазмиды – фрагменты ДНК с небольшой молекулярной массой, несут от 40 до 50 генов. Они выполняют также регуляторную и структурную функцию. Плазмиды могут располагаться либо в цитоплазме, могут иметь кольцевую структуру. Могут находится в интегрированном состоянии хромосомы (эписомы). Свойства плазмид:

  1. Не обязательные генетические элементы бактерий (дополнительные).

  2. Обладают саморепликацией и автономностью, независимостью от хромосомы клетки. ДНК бактерии им не управляет.
  3. Склонны к трансмиссии как по вертикали, так и по горизонтали обеспечивая при этом гегетическую изменчивость бактерий.

Виды плазмид:F-фактор – кольцевая молекула.

Ее гены кодируют образование половых ворсинок, размножение бактерий, скорость размножения с ней связывают конъюгацию, участвует в горизонтальной передаче генетического материала и передаются различные свойства: устойчивость к антибиотикам, лактозо положительность.R-фактор – детерминирует продукцию фермента β-лактамызы → устойчивость к антибиотикам.

В составе этой плазмиды может быть специальный tra-оперон (ген отвечающий за перенос) → плазмида легко передается.Hly – плазмида связана с продукцией гемотоксина → более токсигенные бактерии.Col-фактор отвечает за продукцию колицинов (антибиотикоподобные вещества) обеспечивающих преимущество бактерий перед другими.

Плазмиды био деградации: участвуют в расщепдлении веществ загрязняющих окружающей среды.Плазмида умеренного фага – фаг который способен распознать, внедрится, в клетку, но вызвать лизис бактерии вызвать не может.

Обратите внимание

Может покидать клетку, захватывать часть генетического материала клетки и внедряясь в другую клетку участвует в переносе генетического материала (трансдукция)Плазмиды есть конъюгативные (способные к переносу, имеющие в своем составе ген переноса), неконъюгативные (не участвуют в рекомбинации). По совместимости есть несовместимые друг с другом, совместимые.

^

Относятся к дополнительным генетичесим элементам Th-маленькие участки ДНК (прыгающие) – в составе могут быть Rгены. Могут находится как в составе ДНК, так и в составе плазмид. Странспазонами связны мутации бактерии поскольку они могут перемещаться и вызывать мутации типа делеции, инверсии, дупликации..

Транспазоны ограничены с двух сторон IS-последовательностями.IS-фрагменты – маленькие фрагменты ДНК, повторяющиеся, не способны к репродукции в свободном состоянии не участвуют. Основные функции: регуляторные (способны включить – выключить ген).

Координируют взаимодействие транспазонов плазмид, фагов как между собой так и с хромосомой клетки хозяина.

^

Модификационная: адаптивная реакция организмов в ответ на условия внешней среды. Могут изменять морфологические, культуральные, ферментативные свойства.

Генотипическая: затрагивает генотип клетки:

  • Мутационная – изменение первичной структуры ДНК, могут быть связаны с выпадением нуклеатида, делецией могут носить характер инверсии. Могут быть хромосомные, плазмидные. Могут быть спонтанные, индуцированные.

    Значение эволционные изменение, сопроваждается селекцией.

  • Комбинативная: трансформация – передача генетического материала в виде раствора ДНК донора к реципиенту, трансдукция – перенос генетического материала от донора к реципиенту с помощью умеренных фагов (неспецифическая, специфическая), конъюгация – передача генетического материала от донора имеющего F-фактор к реципиенту через половые ворсинки с образованием новых штаммов.

^

Особенности генетики вирусов.

  1. Молекулярная масса геном вирусов 106 меньше чем масса эукариотической клетки.
  2. Организация генетического аппарата такая же
  3. Генов от нескольких единиц до десятков.
  4. Принцип 1 ген – молекул РНК – 1 белок у вирусных ДНК нарушен и иРНК вирусов может направлять синтез 2 и более белков.

Способы увеличения генетической информации у вируса.

  1. Двукратное считывание одной и той же и РНК, но с другого кодона.
  2. Сдвиг рамки трансляции
  3. Сплайсинг (вырез интронов)
  4. Транскрипция с перекрывающихся областей нуклеиновой кислоты → размывается границы гена и понятие ген приобретает функциональное значение.

^

Модификационная. В основном для вирусов определяет клетка хозяина. Модификация затрагивает суперкапсид.

Генотипическая. Мутационная, то есть изменение в первичной структуре нуклеотидов.

Рекомбинативная. Происходит при одновременном заражении клетки хозяина двумя или более вирусами, происходит обмен генами → образуются рекомбинантные штаммы вирусов, которые содержат гены 2 и более штаммов.

^ . Процесс при котором вирионы дополняют друг друга в следствии перераспределения генов во время их репликации. Это наблюдается у вирусов с фрагментарным геномом. При скрещивании таких вирусов происходит образование полноценных единиц.

Комплементация (дополнение). Не генетический процесс при котором вирус снабжает своего партнера (как правило дефектного) недостающими компонентами белка, а не нуклеиновыми кислотами. Характерна для многих вирусов – аденовирусы могут культивироваться только в присутсвии SV40 – вирус. Вирус гепатита В является помощником для δ – вируса (HDV).

^ . Наблюдается при совместном культивировании двух вирусов наблюдаем, что геном одного вируса заключается в капсид другого вируса. Генотип при этом не меняется

^

Биотехнология использование биологических объектов (клеток микроорганизмов, грибов, животных, людей) для получения полезных для человека продуктов, которые не могут быть получены другим путем. Основное направление это генная инженерия. Появилась с 1972 когда появилась первая работа по генной инженерии.Объект генной инженерии: ген или группа генов.

Источники получения: вирусы, прокарилтыЦель: пересадка гена в другие, гетерогенные системы, экспрессия этого гена и т.о. получать полезные продукты (белки, фермены, гормоны, лекарственные препараты и другие БАВ)

Инструмент генной инженерии: ферменты рестриктазы с помощью которых можно получать фрагменты генома. Рестриктазы имеют липкие концы для сшивания различных генов.

Если их нет используют лигазы.

Этапы генной инженерии:

  1. выделение гена из клетки с помощью рестриктаз из генома клетки.
  2. присоединение гена к вектору (переносчику) – плазмиду, ДНК, РНК втрусов, умеренные фаги, искусственные плазмиды. Основные требования к вектору – должен выполнять роль саморепликации. Этот этап сопроваждается образованием рекомбинантной ДНК (ген+вектор)
  3. введение рекомбинантной ДНК в гетерогенную систему. В качестве этой системы выступает клетка прокариотов, эукариотов, соматическая.
  4. экспрессия введенного гена, создаются условия что бы рекомбинантная молекула начала самореплицироваться и заставила клетку продуцировать вещество, которое кодирует перенесенный ген.
  5. клонирование гена и выделение продукта, очитка продукта и выхода продукта

С помощью генной инженерии получают инсулин, интерферон, гормон роста, тромболитики, антикоагулянты, антигены (ВИЧ, малярийного плазмодия, бледной трипанемы) используют для создания диагностических систем, вакцины (против HBV, ВИЧ, малярии).

Источник: http://userdocs.ru/biolog/35515/index.html

Ссылка на основную публикацию