Сложности идентификации бактерий в современной микробиологии

способ идентификации бактерий

Классы МПК: C12M1/34 измерения или испытания со средствами измерения условий или датчиками, например счетчиками колоний
Автор(ы): Колпакова Светлана Дмитриевна, Колпаков Анатолий Иванович
Патентообладатель(и): Колпакова Светлана Дмитриевна,Колпаков Анатолий Иванович
Приоритеты: подача заявки:1995-06-19
публикация патента:20.06.1998

Использование: изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, а также микробиологическом исследовании окружающей среды. Сущность изобретения: определяют фотоэлектроколориметрическую кривую процесса диффузионного распределения бактериальных клеток при наличии градиента концентрации. По величине времени исчезновения градиента концентрации судят о виде бактерий. 1 табл., 2 ил. Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3
Изобретение может быть использовано в микробиологической практике, и конкретно при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, микробиологическом исследовании объектов окружающей среды. Известен способ биохимической идентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Биргера М. О. , М., 1982), заключающийся в изучении ферментативных свойств микробов (способности сбраживать углеводы и разлагать белковые продукты). Для обнаружения этих свойств бактерий пользуются посевом их на дифференциально-диагностические среды (жидкие и плотные), содержащие вещества, в отношении которых микробы способны проявлять свою ферментативную активность. Основой таких сред является среда Гисса – 1% пептонная вода, к которой добавляется индикатор и то вещество, которое должно разложить ферменты исследуемого микроба. Такими веществами являются углеводы (глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, сахароза, ксилоза, арабиноза, дульцит, рамноза и другие), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), аминокислоты, мочевина и другие вещества. Изменения реакции среды, наступающие в результате деятельности ферментных систем микробов, выражаются в изменении цвета среды после 24 ч культивирования посевов. К недостаткам этого способа следует отнести: – большую длительность проведения исследований, достигающую 24 ч; – большую номенклатуру препаратов, используемых при исследовании; – высокую стоимость материалов, применяемых при исследовании;

– большую трудоемкость.

Известен способ серологической идентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. Биргера М.О. М., 1982). Его проводят с чистой культурой и диагностическими сыворотками в реакциях агглютинации, преципитации и других. Однако такой способ идентификации бактерий очень трудоемкий и дорогой, так как требует изготовления большого количества диагностических сывороток различных серологических вариантов. Кроме этого, серологическая идентификация не приемлема для таких микроорганизмов, как стафилококки из-за обилия его серовариантов. Известен способ фагоидентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Биргера М.О. М., 1982), который основан на способности изучаемого микроба лизироваться соответствующим фагом. Для этого в две пробирки с бульоном засевают культуру определяемых микробов, в одну из которых добавляют фаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Через 20-24 ч культивирования посевов в термостате учитывают по густоте роста (мутности) полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке. К недостаткам данного способа следует отнести: – большую длительность исследования; – необходимость содержания музея фагов;

– высокую стоимость исследований.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату к заявляемому способу является способ идентификации бактерий (Vinas L.D.M., Loren J.G., Bermudes J. Analysis of microcalorimetric curves for bacterial identification. – Can. J. Microbiol., 1987, 33, N 1, p. 6-11). Способ идентификации бактерий заключается в цифровой обработке микроколориметрических кривых роста бактерий с помощью автоматизированной системы идентификации, в основе которого лежит культивирование бактерий при одних и тех же условиях. Коэффициент идентификации вычисляют с помощью компьютера по результатам оценки корреляции и анализа сходства параметров микроколориметирческих кривых идентифицируемых бактерий и кривых сравнения, принадлежащих известным микроорганизмам. К недостаткам этого способа следует отнести: – большую длительность процесса идентификации; – применение дорогостоящего оборудования;

– использование большого количества питательных сред.

Целью изобретения является снижение длительности и стоимости способа идентификации бактерий. Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе регистрируют фотоэлектроколориметрическую кривую процесса диффузного распределения бактериальных клеток в замкнутом объеме жидкой среды при наличии градиента концентрации. Согласно изобретению в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации при заданном объеме жидкой среды и вносимого в среду инокулята. Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации бактериальных клеток в жидкой среде. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения “новизна”. Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие условию патентоспособности “изобретательский уровень”. Осуществление заявляемого способа производится с помощью фотоэлектроколориметра типа КФК-2МП. Методика измерения процесса диффузного распределения бактерий в жидкой среде заключается в следующем. Перед исследованием согласно инструкции по эксплуатации прибора проводится калибровка светового потока путем подбора кювет и светофильтров. Контрольная и опытная кюветы заполняются мясопептонным бульоном до метки на боковой поверхности, помещаются в кюветное отделение фотоэлектроколориметра и выдерживаются при закрытом отделении в течение некоторого времени, необходимого для установления в кюветном отделении и в объеме питательной среды определенной температуры. Температура контролируется при помощи термометра, помещенного в кюветное отделение фотоэлектроколориметра. Исследования проводятся в данном случае при 30oC. После достижения необходимой температуры в опытную кювету микропипеткой вносится стандартная взвесь в физиологическом растворе отмытой от продуктов жизнедеятельности бульонной культуры исследуемых бактерий в объеме 0,2 мл на поверхность питательной питательной среды без ее перемешивания. В контрольную кювету вносится 0,2 мл физиологического раствора. Кюветы стерилизуют смесью Никифорова в течение 30 мин непосредственно перед заполнением их мясопентонным бульоном, тщательно протирают от остатков смеси стерильным тампоном. Величину оптической плотности раствора определяют каждые 5 с на протяжении 15-60 мин при длине волны светового потока 540 нм. На основании полученных цифровых данных строится кривая процесса диффузного распределения бактериальных клеток в жидкой среде и рассчитывается коэффициент диффузии. Согласно II закону Фика коэффициент диффузии связан с расстоянием и временем.

где Co – концентрация бактерий в объеме инокулята;

Cx, t – концентрация бактерий, зависящая от координаты;

x – расстояние, пройденное бактериальной клеткой от поверхности среды в направлении уменьшения градиента концентрации; t – время исчезновения градиента концентрации;

D – коэффициент диффузии.

Поскольку коэффициент диффузии определить довольно сложно с помощью современных методов, поэтому в качестве критерия идентификации бактерий использовали время исчезновения градиента концентрации, то есть время установления постоянной величины оптической плотности исследуемого раствора. В основе предлагаемого способа идентификации лежит механизм диффузного распределения частиц в замкнутом объеме жидкой среды. Сущность предлагаемого способа идентификации бактерий заключается в следующем. С классической точки зрения механизм диффузного распределения частиц осуществим при выполнении двух условий: 1 – наличие градиента концентрации, 2 – наличие теплового движения. Убитая микробная клетка представляет собой объект, близкий к твердому телу, то есть является частицей, обладающей только тепловым движением. Каждый вид микроорганизмов имеет свои морфологические признаки, такие как размеры бактериальной клетки, форма, которыми определяется характер сопротивления окружающей среды при тепловом перемещении микробных клеток. Иначе говоря, каждый микроорганизм должен обладать своей индивидуальной скоростью теплового перемещения в объеме жидкой среды при наличии градиента концентрации. Следовательно, время исчезновения градиента концентрации является индивидуальным признаком для каждого вида микроорганизмов и может служить критерием их идентификации, если исследования проводить при неизменности таких параметров, как состав и однородность среды, pH, температура среды, возраст инокулята исследуемой культуры, доза инокулята. Выполнение этих условий с технической точки зрения представляет собой достаточно легкую задачу. Что же касается живых микроорганизмов, то они также могут быть приняты в качестве неживого объекта в начальный период своего развития, который в литературе описывается как период диффузного распределения бактериальных клеток (Колпакова С.Д., Колпаков А.И. Исследование особенностей механизмов развития бактерий в лаг-фазе. – Бюл. экспер. биологии и медицины, 1994, N 3, с. 331-336). Однако живые микроорганизмы помимо теплового движения могут иметь индивидуальный механизм своего перемещения в питательной среде даже при отсутствии градиента концентрации, обусловленный наличием у них органов передвижения – жгутиков, ресничек, осевых нитей и т.д., которые определяют индивидуальный характер их движения. Характер и скорость перемещения бактериальной клетки в питательной среде в данном случае определяется количеством жгутиков, местом и характером их расположения. В связи с этим у живых подвижных микроорганизмов, обладающих высокой индивидуальной скоростью передвижения, не всегда удается зарегистрировать период диффузного распределения, а следовательно, определить время исчезновения градиента концентрации. Но при наличии соответствующего оборудования предлагаемый способ идентификации станет приемлемым и для данной группы микроорганизмов. Ниже приводится конкретный пример осуществления заявляемого способа. В качестве исследуемых бактерий использовали музейные штаммы – Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella choleraesuis. Результаты исследований представлены на фиг. 1, 2. Из-за отсутствия устройства, реализующего способ прототипа, практическое сравнение результатов идентификации бактерий по предлагаемому способу было осуществлено с более доступным способом – аналогом – биохимической идентификацией, как наиболее распространенным среди группы приведенных бактерий. Результаты биохимической идентификации исследуемых бактерий, проведенной с использованием тест-систем API – 20, Enterotest и сред Гисса, представлены в таблице. На фиг. 1 представлены кривые процесса диффузного распределения убитых, а на фиг. 2 – живых микробных клеток E. coli (кривая 1), E. aerogenes (кривая 2), S. choleraesuis (кривая 3). Из анализа кривых, представленных на фиг. 1, видно, что, во-первых, характер диффузного распределения у разных видов бактерий различен. Во-вторых, различно время исчезновения градиента концентрации в объеме рабочего раствора, то есть время установления постоянного значения оптической плотности. Например, для E. coli время установления постоянного значения оптической плотности равно 40 мин, для E.aerogenes – 60 мин, для S. choleraesuis – 30 мин. Что же касается живых бактерий тех же видов, то анализ представленных на фиг. 2 кривых показал, что время исчезновения градиента концентрации также различно для каждого из указанных видов, хотя и значительно сокращается. Например, время исчезновения градиента концентрации для E. coli равно 12 мин, для E. aerogenes – 8 мин, для S. choleraesuis – 5 мин. Измерение процесса диффузного распределения бактерий каждого вида в жидкой среде определялось 20 раз. Погрешность эксперимента составляет 5-7%. Из анализа результатов сопоставления видно, что предлагаемый способ идентификации бактерий отличается от прототипа и аналогов:

1. Небольшой длительностью процесса идентификации (15-60 мин).

2. Экономически более выгоден, так как не требует применения дорогостоящего оборудования, большой номенклатуры питательных сред, содержания музея фагов.

Формула изобретения

Способ идентификации бактерий, включающий регистрацию фотоэлектроколориметрической кривой процесса диффузного распределения бактериальных клеток в жидкой среде при наличии градиента концентрации, по которой идентифицируют бактерии, отличающийся тем, что в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации при заданном объеме жидкой среды и вносимого в среду инокулята.

Источник: http://www.freepatent.ru/patents/2113467

Использование ферментативной активности бактерий для идентификации микроорганизмов

Каждый вид микроорганизмов характеризуется специфическим набором ферментов, в связи с этим определение ферментного спектра является важнейшим этапом идентификации микроорганизмов. О наличии ферментов судят по способности микроорганизмов воздействовать на определенный субстрат.

Проявление ферментативной активности характеризуется изменением физического состояния субстрата (разжижение желатины), закислением питательной среды (среды Гисса с углеводами, среда Ресселя, среда Олькеницкого), образованием определенных продуктов метаболизма (индол, сероводород, аммиак) и т.

д.

В идентификации видовой принадлежности особенно важное значение имеет определение у бактерий гидролаз и оксидоредуктаз. Группу гидролаз по действию на различные вещества практические микробиологи делят на сахаролитические, протеолитические, липолитические ферменты.

Обратите внимание

Определение сахаролитических гидролаз (карбогидраз — ферментов, разлагающих углеводы) проводят с помощью биохимического ряда Гисса.

Определение протеаз — ферментов, разлагающих белки, проводят путем обнаружения газов, являющихся конечным продуктом ферментации белков (индол, сеоводород, аммиак) с помощью специальных индикаторов.

Липазы — ферменты разлагающие липиды, чаще всего определяют наличие лецитиназы посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид в этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие мутные зоны, отражающие лецитиназную активность.

Среди оксидоредуктаз различают оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы. Определение последних имеет важное значение для дифференциации обширных групп родственных микроорганизмов (например, семейства Enterobacteriaceae).

Наиболее распространены следующие методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

4. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

Читайте также:  Почему кишечник человека не может функционировать без бактерий

Сахаролитическиесвойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа чаще всего изу­чают на дифференциально-диагностических средах Гисса, которые содержат питательный агар, тот или иной углевод и индика­тор Андреде (ВР или др.).

В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крах­мал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.

), в про­цессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты (СО2, Н2, СН4).

В состав короткого “пестрого” ряда Гисса входит 5 углеводов: глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза и сахароза. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами.

Важно

Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроорганизмов одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и соответственно цвет питательной среды.

По консистенции среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца.

“По­плавок” помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности.

Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Критерии учета результатов:

· цвет среды не меняется — культура не ферментирует углевод;

· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде — со светло-желтого на красный, ВР — с розового на синий и т. д.) — культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот), пробирку отмечают буквой «К»;

· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке — культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов. Такую пробирку отмечают буквами «КГ».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находя­щийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кис­лота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Таблица 18. Дифференциально-диагностические среды

Наименование и внешний вид среды Состав (компоненты) Назначение Принцип действия и внешний вид среды после посева
Среда Эндо Бледно-розовая плотная сре­да, разливается в чашки Петри Питательная основа-МПА, субстрат — лактоза, индикатор — основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия (Na2SO3) Для рассева исследуемого материала (нативного или после обогащения) с целью получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных знтеробактерий: эшерихий, сальмонелл, шигелл, йерсиний и других. На среде можно наблюдать рост красных или бесцветных колоний. Эшерихии разлагают лактозу до кислых продук­тов, в том числе альдегидов, они соединятся с сульфитом натрия, при этом освобождается фуксии, который окраши­вает колонии и среду в красный цвет, часто с метал­лическим зеленоватым блеском (lac+). Сальмонеллы и шигеллы не разлагают лактозу и образуют бесцветные колонии (lac-).
Среда Левина Плотная среда красновато-фиолетового цвета. Среда является дифференциально-диагностической и слабо се­лективной, так как оказыва­ет ингибирующее действие на грамположительную микрофлору Питательная основа-МПА, Субстрат — лактоза. Индикаторы — эозин и метиленовый синий Для получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных энтеробактерий — см. среду Эндо. Среда Левина может быть использована также для выделения грибов Candida albicans На среде можно наблюдать рост синих или бесцветных колоний. Escherichia coli, разлагающая лактозу, вызывает сдвиг рН в кислую сторону, при этом комплекс индикаторов эозина и метиленового синего выпадает в осадок и колонии приобретают темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с металлическим блеском (положительный результат lac+). Энтеробактерии не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные колонии lac-.
Среды Гисса Набор пробирок с полужидкой средой розового цвета. Питательная основа — полужидкий МПА (0,4%), Субстрат (в каждой пробирке разный углевод), Индикатор — бром крезоловый пурпурный или BP (водный голубой и розоловая кислота) Определение спектра сахаролитической активности с целью идентификации (определение родовой и видовой принадлежности) выделенной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также других семейств и родов. При ферментации субстрата образуются кислые продукты (молочная, уксусная, муравьиная и другие кислоты), кото­рые снижают значение рН и розовый цвет индикатора изменяется на синий, что указы­вает на положительную реакцию. При образовании газа (Н2 и СО2;) — пузырьки и трещины в толще среды. Рост бактерий в среде Гисса без изменения ее цвета свидетельствует об отсутствии фермента, расщепляющего данный углевод, то есть об отрицательной реакции

5. Методы определения протеолитической активности бактерий

Протеолитическая активность микробов направлена на расщепление белков до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов. Действие протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Тест на желатиназу. Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины.

Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер.

Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки — в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина. Культуру засевают на обезжиренное молоко.

Совет

Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина).

При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется — пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой сыворотке крови. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола. Для обнаружения индола по спо­собу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают.

Индикатор­ную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобре­тает розовый цвет.

Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты — триптофана.

Определение сероводорода. Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бу­маги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют меж­ду стенкой засеянной пробирки и пробкой.

При взаимодействии серово­дорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования суль­фида свинца.

Тест на аммиак.Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Источник: https://cyberpedia.su/9×13783.html

Доклад Современные методы идентификации микроорганизмов студентка 1 курса магистратуры

страница 1

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Базовая кафедра биотехнологии

Доклад
Современные методы идентификации микроорганизмов.

Выполнила: студентка 1 курса магистратуры

Гр. ББ1201Б

Ларионова М.Д.

Проверила: Литовка Ю.А.

Красноярск 2012

В настоящее время учеными описано несколько тысяч видов организмов, однако считается, что это составляет менее 1% от реально существующих.

Цель идентификации – установить таксономическое положение исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и принятыми (официально зарегистрированными) видами.

Принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и эукариот имеют существенные различия.

Обратите внимание

Идентификация дрожжевых грибов, которые относятся к числу широко используемых объектов разных микробиологических исследований, основана на культуральных, морфологических, цитологических, физиолого-биохимических особенностях, характеристике жизненных циклов и полового процесса.

Идентификация прокариот, которые морфологически менее разнообразны, чем эукариоты, основана на использовании широкого спектра фенотипических и генотипических признаков. Она в большей степени, чем идентификация эукариот, основывается на функциональных признаках, поскольку большинство бактерий можно идентифицировать не по внешнему виду и по процессам, которые они способны осуществлять.

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина в ДНК, последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем синтез 16S рРНК и другие фено- и генотипические признаки.

Культуральные свойства, т.е. характерные особенности роста бактерий на плотных и жидких питательных средах обычно используют для их характеристики, однако для идентификации применяют довольно редко.

Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию.

Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем и органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуолей и т.д.), присущих отдельным группам бактерий, а также включений (параспоральных телец, гранул волютина, полигид-роксибутирата, полисахаридов и т.д.).

Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок.

Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего установление способа питания исследуемой бактерии (фото / хемо-, авто / гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фотосинтезу).

Важно

Важно определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим факторам среды.

В данную группу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого используют специальные тесты.

Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных признаков, важны для диагностики и широко используются в медицинской микробиологии. Их постановка требует значительных затрат времени, большого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стандартных условий проведения.

Для ускорения и облегчения процесса идентификации некоторых микроорганизмов, имеющих главным образом медицинское значение, разработаны различные тест-системы.

Например, система Enterotube, предназначенная для идентификации энтеробактерий, представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды.

О положительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование), или после введения специальных реактивов. Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

Определение химического состава клеток бактерий также имеет значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические методы могут быть важными, для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетворительной идентификации.

В состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов уникальных гетерополимеров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. В качестве хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Состав клеточной стенки определяет и серологические свойства бактерий.

Это лежит в основе иммунохимических методов их идентификации.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление – белковая таксономия.

Совет

Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия.

Читайте также:  Искусственно созданная бактерия с именем синтия – биологическое оружие нового поколения

Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.

Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической (или адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи французского ботаника М. Адансона (М.

Adanson), предложившего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных.

Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки не менее 100 фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты могли обозначаться знаками «минус» или «плюс».

Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства.

S = (a+b) / a+b+c+d,

Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 – полное несходство. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и / или в виде дендрограммы.

Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства.

Обратите внимание

Особой проблемой является идентификация таких бактерий и архей, особенно морских видов, которые не способны расти на известных лабораторных питательных средах, и для которых нельзя было получить чистую культуру. До недавнего времени эта проблема казалась неразрешимой.

Однако около 15 лет назад были разработаны методы, позволившие экстрагировать, клонировать, секвенировать и сравнивать рРНК прямо из окружающей среды. Это позволило точно сосчитать и идентифицировать микроорганизмы, населяющий данный биотоп без их выделения в чистую культуру.

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.

Филогенетические взаимоотношения бактерий оценивают определением молярного содержания ГЦ в ДНК, методами ДНК-ДНК и ДНК-рРНК гибридизации, с помощью ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 5S, 16S и 23S рРНК.

Определение молярного содержания ГЦ от общего количества оснований ДНК у прокариот колеблется от 25 до 75%. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным содержанием ГЦ. Однако если два организма очень близки по нуклеотидному составу, то это может являться свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они обладают большим числом фенотипических признаков.

Гибридизация. Методы гибридизации ДНК состоят в смешивании одноцепочечных фрагментов ДНК, полученных от двух разных видов. Доля в смеси общей ДНК, которая воссоединяется, образуя двухцепочечные спирали, и скорость воссоединения служат мерами степени генетического родства между данными видами. Этот метод широко применяется зоологами, ботаниками и другими исследователями.

Метод ДНК-ДНК-гибридизации является более важным для оценки генетического родства бактерий. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает 70-100%.

Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательностей нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК-ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению.

В таком случае гибридизация ДНК-рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК-рРНК-гибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК-ДНК не выявляет заметной гомологии.

Важно

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов – разновидность метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК.

Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим генетический маркер (ген), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии.

Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии, затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК.

Далее выбранный фрагмент ДНК сшивают с подходящей плазмидой, и полученную рекомбинантную плазмиду вводят в удобный штамм бактерий (например, в E.coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию генетического зонда с ДНК бактерии.

Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом.

Для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации наиболее широкое распространение и значение получил метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности.

Считается, что они находятся вне механизма естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. В случае анализа 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120 нуклеотидов.

При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих молекул при помощи специфических рестриктаз.

Совет

При выполнении данных методик исследований необходимо проведения ряда последовательных операций.

Первая – разрушение клеток, выделение нуклеиновых кислот и при необходимости их дополнительная очистка с помощью соответствующих наборов реактивов. Следующая – амплификация исследуемых участков в выделенной смеси НК для увеличения концентрации этих фрагментов с применением соответствующих праймеров в ПЦР-реакции. Полученные ПЦР-продукты – концентрированная смесь амплифицированных участков, принадлежащим различным бактериям, разделяют, например методом ДГГЭ (Денатурирующего градиентного гель-электрофореза). Если на этой стадии ввести соответствующие контроли, томожно провести предварительную идентификацию бактерий. Однако для достоверной идентификации нужно производить изъятие отдельных полос их электрофореграммы геля для последующего секвенирования. Выявленные последовательности сравнивают с данными, имеющимися в международном банке генов, после чего составляют списки выявленных организмов и строят филогенетические схемы микробного сообщества.

В настоящее время также разработаны иммунофлуоресцентные методы (ИФМ), позволяющие выявить интересующий исследователя организм без выделения в чистую культуру. В основе любых модификаций ИФМ используется взаимодействие антиген-антитело, которое соединено с флуоресцирующим красителем. Специфичность реакции антиген-антитело высока, поэтому и вероятность выявления микроорганизма в природных образцах или накопительных культурах тоже высока. Недостатком являются относительно долгая процедура приготовления сывороток с красителями и существование перекрестных реакций.

Недостатков ИФМ лишен метод, основанный на взаимодействии флоуресцентно окрашенных олигонуклеотидов с соответствующими участками 16S рРНК целых клеток (метод FISH – Fluorescent in situ hybridization). При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды, которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

В настоящее время с помощью молекулярно-генетических методов идентификация бактерий стала менее трудоемким процессом, зачастую не требующим выделения бактерий в чистую клеточную культуру. Благодаря этому современные квалифицированные специалисты – медики, микробиологи, эпидемиологи – теперь способны проводить микробиологические исследования в считанные часы.

Источник: http://vmest.ru/nuda/doklad-sovremennie-metodi-identifikacii-mikroorganizmov-studen/main.html

Рост и размножение бактерий (продолжение…)

Принципы культивирования и идентификации бактерий

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов – риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах.

В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Обратите внимание

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша – в 2-3 сутках, а микобактерий туберкулеза – в 3-4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах – анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава.

Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике. В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки.

Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

Для идентификации, т.е.

определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипичес-кие признаки:

  • морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах;
  • биохимические признаки культуры по ее способности фермен тировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хромографию и другие методы.

Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции: агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др.

В настоящее время все более широкое применение в медицинской микробиологии находят генотипические методы, основанные на определении гомологии ДНК искомого микроорганизма в исследуемом материале, с эталонной ДНК. С этой целью используют полиме-разную цепную реакцию (ПЦР) и генетические зонды, сэндвичгибридизацию.

Для постановки ПЦР ДНК-праймер – короткую однонитевую последовательность нуклеотидов, комплементарную начальному и конечному участку ДНК, – в избытке добавляют к нуклеиновой кислоте выделенной из исследуемого материала. После этого проводят гибридизацию. При наличии искомого гена происходит его гибридизация с праймером. После добавления ДНК-полимеразы и нуклеотидов начинается достраивание ДНК. Весь цикл многократно повторяется, в результате чего происходит амплификация генов, которые легко обнаруживаются. ПЦР в настоящее время широко применяется для диагностики большинства бактериальных и вирусных инфекций. Наряду с ПЦР для генетической идентификации применяют нуклеиновые зонды.

Важно

Зонд представляет собой плазмидную ДНК с интегрированным в нее фрагментом ДНК, меченным контрастным веществом или радиоактивной меткой. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после чего определяется степень его гомологии и исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить диагноз заболевания.

Источник: https://www.eurolab.ua/microbiology-virology-immunology/3660/3667/30341/?page=2

Методы выделения и идентификации бактерий

Микроскопия материала

Любое бактериологическое исследование начинается с микроскопии материала и его последующего посева на питательные среды. Эффективность выделения возбудителя в значительной степени обусловлена правильной техникой отбора образцов клинического материала, своевременностью их доставки в лабораторию и правильным хранением образцов.

Читайте также:  Для чего нужны ферменты бактериям, их польза и вред для человека

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена.

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.  

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).  

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред.

В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы.

Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода.

Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбудителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на различных средах может дать много полезной информации.

На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды.

Совет

На твёрдых средах бактерии формируют колонии — изолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размножения одной или нескольких клеток.

Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных средах имеет больше характерных особенностей.

Гемолиз

Некоторые бактерии выделяют гемолизины — вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления.

Образование гемолизинов (и соответственно — размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14).

Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску. Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленящих стрептококков.

β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера.

Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, a Listeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae — небольшие, диффузные зоны.

Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующиеся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний — их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний — признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев колонии грамположительных бактерий мельче колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавленный или приподнятый центр. Другой важный признак — форма краёв колоний. При изучении формы колоний учитывают характер её поверхности: матовый, блестящий, гладкий или шероховатый.

Края колоний могут быть ровными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы колоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S – и R – duc социации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью.

R-колонии — неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

Цвет колоний

Обратите внимание

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже — красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги.

Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специальных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, колонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы.

В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Консистенция колоний и особенности роста на среде

Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй.

Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой.

Мягкие колонии — маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают к петле) или низкими (тянущимися за петлёй).

Твёрдые колонии — сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.

Запах

Запах — менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий — молочной сыворотки, протеев — гнилостный запах, нокардий — свежевскопанной земли.

Биохимические методы идентификации бактерий

Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов.

При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид.

Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Расщепление белков

Важно

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ.

При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз.

Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H2S.

Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумажка краснеет),во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H 2 S бумажка чернеет).Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты.

Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса.

При положительном результате наблюдают появление красного кольца.

Хроматография

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий.

Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии.

Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий.

Совет

У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Индикаторные бумажки

Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.

Система индикаторных бумажек (СИБ) — набор дисков, пропитанных различными субстратами.

Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии.

Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37  °С.

Наборы мультимикротестов — пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37 °С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др.

, позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

Автоматические системы идентификации бактерий

Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.

Системы Microscan. Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа — 2 ч).

Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа — 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek.

В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками. В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке.

В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически.  

Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Обратите внимание

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот. Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты. Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе и его сэндвич- модификация распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

Источник: http://biofile.ru/bio/21045.html

Ссылка на основную публикацию