Особенности и принципы выделения чистых культур бактерий

Этапы выделения чистых культур аэробных бактерий

Особенности и принципы выделения чистых культур бактерий

1-й этап:

а) забор материала для исследования;

б) транспортировка, хранение, подготовка к исследованию;

в) приготовление мазков из патологического материала, окраска по Граму и микроскопия;

Мазок из патологического материала Окраска ______________ Увеличение _____________  

г) посев патологического материала на плотные пластинчатые питательные среды (лучше ДДС или селективные) с целью получения изолированных колоний. Инкубация в термостате.

2-й этап:

а) изучение характера роста изолированных колоний на средах (культуральные признаки) с целью отбора подозрительных колоний; приготовление мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму);

б) пересев оставшейся части колоний на скошенный агар с целью накопления чистой культуры. Инкубация в термостате.

Изучение подозрительных колоний (эшерихий, стафилококка)

Изучаемые культуральные свойства 1-й тип колоний 2-й тип колоний
– форма колонии
– размер колонии
– цвет
– характер края
– характер поверхности

Приготовление мазков из отобранных колоний (окраска по Граму).

Морфология микроорганизмов из изолированных колоний(окраска по Граму)

Мазок колонии 1-го типа Окраска ____________ Увеличение ___________   Мазок колонии 2-го типа Окраска ______________ Увеличение _____________

3-й этап:

Идентификация выделенных чистых культур:

а) морфологические и тинкториальные свойства (приготовление мазка со скошенного агара, окраска по Граму, при необходимости – другие способы окраски);

б) культуральные свойства;

в) биохимические свойства;

г) антигенные свойства.

Также в ряде случаев проводится определение чувствительности культуры к антибиотикам.

Заключение:указывается вид выделенного микроорганизма, при необходимости указываются результаты по чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Культивирование анаэробных бактерий

Методы создания анаэробиоза: __________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

Питательные среды для культивирования анаэробных бактерий:

Среда Вильсона-Блера:

Обратите внимание

Питательная основа____________________________________________________________________________

Дыхательный субстрат__________________________________________________________________________

Важно

Редуцирующий фактор__________________________________________________________________________

Тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности/СКС):

Обратите внимание

Питательная основа____________________________________________________________________________

Дыхательный субстрат__________________________________________________________________________

Важно

Редуцирующий фактор__________________________________________________________________________

Глюкозjо-кровяной агар Цейсслера:

Обратите внимание

Питательная основа____________________________________________________________________________

Дыхательный субстрат__________________________________________________________________________

Важно

Редуцирующий фактор__________________________________________________________________________

Среда Кита-Тароцци:

Обратите внимание

Питательная основа____________________________________________________________________________

Дыхательный субстрат__________________________________________________________________________

Важно

Редуцирующий фактор__________________________________________________________________________

Сахарный агар:

Обратите внимание

Питательная основа____________________________________________________________________________

Дыхательный субстрат__________________________________________________________________________

Этапы выделения чистых культур анаэробных бактерий

1-й этап:

а) забор материала для исследования;

б) транспортировка, хранение, подготовка к исследованию;

в) приготовление мазков из патологического материала, окраска по Граму и микроскопия;

г) посев патологического материала на жидкие питательные среды для анаэробов. Инкубация в термостате в анаэробных условиях.

2-й этап:

Совет

а) изучение характера роста на жидких средах, приготовление мазков, окраска по Граму, микроскопия;

б) пересев на плотную пластинчатую питательную среду с целью получения изолированных колоний. Инкубация в термостате в анаэробных условиях.

3-й этап:

а) изучение характера роста изолированных колоний на средах (культуральные признаки) с целью отбора подозрительных колоний, приготовление мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму);

б) пересев оставшейся части колонии в жидкую питательную среду с целью накопления чистой культуры. Инкубация в термостате в анаэробных условиях.

4-й этап:

Идентификация выделенных чистых культур:

а) морфологические и тинкториальные свойства (приготовление мазка, окраска по Граму);

б) культуральные свойства;

в) биохимические свойства;

г) антигенные свойства;

д) определение токсигенности.

Также в ряде случаев проводится определение чувствительности культуры к антибиотикам.

Заключение:указывается вид выделенного микроорганизма, при необходимости указываются результаты по чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

ЗАНЯТИЕ № 5

ТЕМА: БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОФАГИЯ.

Источник: https://stydopedia.ru/3xa3f1.html

Этапы выделения чистых культур Идентификация микроорганизмов РАЗМНОЖЕНИЕ

Этапы выделения чистых культур. Идентификация микроорганизмов

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ НА ЖИДКИХ И ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ. ФАЗЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ • Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. • Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. • В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем, их колонии образуются через 18— 20 ч, либо через 3— 5 нед. соответственно. 2

Кривая роста микроорганизмов Время культивирования 3

Особенности микробного роста на жидких питательных средах • 1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды. • 2. Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. • 3. Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда. • 4. Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки. 4

Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов I этап (нативный материал) • Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). • Посев на плотные питательные среды (получение колоний). II этап (изолированные колонии) • Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). • Микроскопическое изучение микроорганизмов в окрашенном мазке (морфологические свойства бактерий). • Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры. III этап (чистая культура) • Определение культуральных, морфологических, биохимических и других свойств для идентификации культуры бактерий 5

Обратите внимание

Выделение чистой культуры Культуральные свойства: Характеристика колоний микроорганизма 6

Морфологическое и структурное разнообразие колоний 1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды; 2 — очертания колоний; 3 — характер края колоний; 4 — внутренняя структура колоний. 7

Форма колоний: а – круглая; б – круглая с фестончатым краем; в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем; ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная 8

Профиль колоний а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый; ж – каплевидный; з – конусовидный 9

Край колоний а – гладкий; б – волнистый; в – зубчатый; г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый; ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и – ветвистый 10

Пигменты бактерий • Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением окрашивающего вещества в среду либо окраской самих бактерий. Среди пигментов преобладают жёлтые, оранжевые и красные каротиноидные пигменты. • Пигменты бактерий — вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами, обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratia marcescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы. • Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован, поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия. • Пигменты: 1. участвуют в метаболизме бактерий, 2. повышают их устойчивость к химическим веществам, 3. защищают бактерии от действия видимого света и УФ-лучей. Мутанты, лишённые способности к пигментообразованию, быстро погибают на свету. Искусственно окрашенные бактерии (например, метиленовым синим) также проявляют повышенную лабильность к инсоляции. Бактерицидное действие солнечного света проявляется в присутствии кислорода и обусловлено фотоокислением. При этом клеточные пигменты (флавины и цитохромы) действуют как катализаторы. • Каротиноиды ингибируют этот процесс. У некоторых бактерий образование пигментов происходит только на свету. • Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между пигментацией и образованием вторичных метаболитов существует такая тесная корреляция, что при наличии пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других БАВ. 11

Пигменты микроорганизмов Пигмент Цвет Микроорганизм Каротиноиды Красный, оранжевый, желтый Микобактерии, сарцины, актиномицеты (защищает от ультрафиолета) Хиноновые Желтые Микобактерии туберкулеза Меланиновые Черные, коричневые бактериоиды Пирроловые Ярко-красные Serratia marcescens, актиномицеты Фенозиновые Сине-зеленые, при Синегнойная этом может палочка меняться (пиоцианин) 12

Биохимические признаки (свойства) бактерий • определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту микроорганизмов • Выявляют посевами на дифференциальнодиагностические среды 13

Важно

Ферменты бактерий • Энзимы – специфические белки, которые катализируют химические реакции. • Классификация ферментов бактерий: 1. По типу катализируемой реакции – оксиредуктазы, лиазы, трасферазы, гидролазы и т. д. 2. По локализации – эндоферменты – катализируют реакции внутри клетки. Экзоферменты – выделяются из бактериальной клетки, катализируют расщепление 3. Генетический контроль образования – конститутивные (в течение всего жизненного цикла, не влияет наличие субстрата), индуцибильные – они образуются в ответ на наличие субстрата 4. По субстрату – протеолитические – расщепляют белки, сахаролитические – расщепляют углеводы, липолитические – расщепляющие жиры. 14

Протеазы • расщепляют белки до аминокислот, мочевины, индола, сероводорода, аммиака. По выделению этих продуктов на средах с белком выявляют наличие протеаз. Среды: • С желатином, разжижение среды • На свернутой сыворотке по ее разжижению • На молоке по его просветлению • Казеин – будет разрушаться, белок свертываться. • На МПБ по выделению газа индола и сероводорода, которые выявляют с помощью индикаторных бумажек 15

Протеолитические свойства микроорганизмов 1 – формы разжижения желатина; II – определение сероводорода; III – определение индола: 1 – отрицательный результат; 2 – положительный результат 16

Бумажные индикаторные системы • представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами и покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером — водным раствором поливинилового спирта. 17

Читайте также:  Эндоспоры как способ выживания бактерий

Сахаролитические ферменты • расщепляющие углеводы • Эти ферменты расщепляют углеводы до альдегидов, кислот, углекислого газа и H 2. • Для их определения используют МПБ или МПА, к которым добавляют индикатор кислотообразования + углевод + поплавок для газообразования. • Пример – среды Гисса. Если свет среды меняется, выделяется газ, значит идет расщепление углеводов (моносахара). • На этом принципе создаются панели, планшеты, бумажные индикаторные системы и приборы для учета ферментативной активности. 18

Среды Гисса 19

Липолитические ферменты – липазы – выявляют на ЖСА – желточносолевой агар, который содержит желток, разрушение липидов желтка сопровождается помутнением среды 20

Комплексная система идентификации бактерий • Микробиологический анализатор Multiskan FC Позволяет идентифицировать более 500 видов микроорганизмов и патогенных грибов. Система микробиологической диагностики включает оценку данных, полученных в результате проведения исследований по идентификации микроорганизмов и определении их антибиотикочувствительности in vitro, и коррекцию их на основании сведений о природной устойчивости или чувствительности отдельных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также сведений о корреляции данных по чувствительности, полученных in vivo, клинической эффективности антибактериальных препаратов. 21

22

Бактериофаги Вирулентные фаги. Прогрессивная инфекция Умеренные фаги. Лизогенная инфекция • Лизогения – ДНК фага включается в кольцевую хромосому бактериальной клетки. Во время деления клетки профаг (интегрированная ДНК фага) реплицируется в составе клеточного генома и переходит в следующие поколения бактерий. Бактериальная культура, инфицированная умеренным фагом, сохраняет жизнеспособность и становится лизогенной • Лизогенная (фаговая) конверсия – процесс изменения свойств бактерии, под действием дополнительного набора генов, внесенных профагом в клетку, с приобретением ею токсигенных свойств (например, появление способности к образованию экзотоксина у возбудителей ботулизма, дифтерии и т. д. ).

Совет

ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ОТТО (МЕТОД СТЕКАЮЩЕЙ КАПЛИ) На чашку с МПА шпателем выполняется посев суточной бульонной выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.

ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФЮРТА • В расплавленный и остуженный МПА (45 -500 С) добавляют определенный бактериофаг и выливают в чашку Петри. Чашка с полученным агаром делится на несколько секторов, в каждый из которых засеваются неизвестные культуры, выделенные от больных. Там, где культура соответствует бактериофагу, наблюдается отсутствие роста (лизис) бактерий.

ФАГОТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФИШЕРА • Испытуемую суточную бульонную культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага.

Титрование в жидкой среде по Аппельману Литическое действие бактериофагов (справа – положительный результат)

ТИТРОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГА ПО МЕТОДУ ГРАЦИА Ряд последовательных разведений фага по 1, 0 мл смешивают в пробирке с 0, 5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПА. Все содержимое выливают в чашку с МПА. Дают застыть верхнему тонкому слою и ставят в термостат. При встрече фага с бактерией, происходит лизис последней и образуется негативная колония фага. Такие негативные колонии затем подсчитывают для определения титра. Титром фага называют количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага.

Применение бактериофагов в диагностике и медицине • Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), лиофильно высушенными, в таблетках и свечах. Таблетки фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока. • Препараты бактериофага составлены из вирулентных бактериофагов широкого спектра действия, активных против антибиотикорезистентных бактерий. Перед применением необходимо определить фагочувствительность возбудителя инфекции. • Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.

Бактериофаг дизентерийный поливалентный Иммунопрепарат (г. Уфа) (Россия) Бактериофаг клебсиелл пневмонии Микроген НПО ФГУП (Биомед НПО (г. Пермь)) (Россия) Бактериофаг коли жидкий Биомед (г. Пермь) (Россия) Бактериофаг колипротейный жидкий Им. Био-Нижегородское ГП по произ. бакпреп (Россия) Бактериофаг сальмонеллезный Им. Био-Нижегородское ГП по произ. бакпреп (Россия) Бактериофаг синегнойный жидкий Биомед (г. Пермь) (Россия) Бактериофаг стафилококковый жидкий Микроген НПО (Россия) Бактериофаг стрептококковый жидкий Микроген НПО ФГУП (Биомед НПО (г. Пермь)) (Россия)

Спасибо за внимание!

Источник: https://present5.com/etapy-vydeleniya-chistyx-kultur-identifikaciya-mikroorganizmov-razmnozhenie/

Этапы выделения чистых культур бактерий, и идентификация

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары.

Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти­генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами.

Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами.

Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения …
одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований — идентификации,которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Обратите внимание

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Источник: http://refac.ru/etapy-vydeleniya-chistyx-kultur-bakterij-i-identifikaciya/

Биология для студентов – 23. Чистые культуры микроорганизмов. Методы получения и назначение

В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур различных видов бактерий, существующих в естественных условиях.

Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2–3 суток, однако для некоторых (например, бактерии туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4–6 недель. Чистой культурой микроорганизмовназывают популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки.

Выделение чистой культуры предполагает проведение трех этапов:

  1. получение накопительной культуры;
  2. выделение чистой культуры;
  3. определение чистоты выделенной культуры.

Методы получения накопительной культуры

В основе выделения и определения численности представителей отдельных групп микроорганизмов лежит получение накопительных культур с помощью создания элективных условий. Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов.

Элективными называют условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов. При создании элективных условий учитывают особенности физиологии и метаболизма микроорганизмов: требования их к источникам питания, отношение к кислотности среды, аэрации, температуре, способность к образованию эндоспор и т.д.

Особенно часто элективные условия создают путем подбора соответствующей питательной среды.

Источником для получения бактериальных культур, родовую и видовую принадлежность которых необходимо определить, могут служить почва, воздух, вода, пищевые продукты, надземные и подземные части растений, а также различные тканевые жидкости животных и человека, отделяемое ран, слизистой оболочки и т.д.

Методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного микроорганизма за счет создания благоприятных условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его из популяции.

К физическим методам, которые могут быть использованы при получении накопительной культуры, следует отнести:

  • регуляцию роста температурой,
  • тепловую и ультразвуковую обработку,
  • ультрафиолетовое облучение и др.

Можно использовать также и особенности некоторых других физических свойств данного микроорганизма, например, его размеры, подвижность, что позволяет отделять данный микроорганизм от других членов популяции. В качестве примеров можно привести следующие:

  • Использование освещения для получения культур цианобактерий.Такие виды легко выделяются из пресной воды и морских осадков. Для получения накопительных культур, образцы инкубируют при 25 °С и постоянном освещении от 500 до 3000 лк. Через 4–7 дней наблюдается увеличение мутности культуры, имеющей часто розовую, коричневую, желтую окраску.
  • Инкубация при низкой температуре для получения культур психрофильных бактерий.Низкая температура способствует задержке роста многих бактерий. На первом этапе проводят инкубирование при температурах 0–5 °С в течение 14–24 дней.
Читайте также:  Как и когда происходит заселение детских бактерий в желудок и кишечник

При использовании химических методов применяют токсические вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый микроорганизм. Кроме того, эти вещества могут быть источниками питания, используемыми преимущественно отдельными бактериями в смешанной популяции.

Примерами использования химических методов для выделения микроорганизмов являются следующие:

  • Условия инкубирования в кислой среде для выделения культур лактобацилл.Для выделения бактерий из сыров, высев производится на среду, которая за счет ацетатной буферной системы имеет рН, равный 5,3. В этом случае Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum способны образовывать колонии, а другие молочнокислые бактерии – нет.
  • Ингибирование роста пенициллином для получения культур микоплазм.Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост многих бактерий с клеточной стенкой. Антибиотик, добавленный к питательной среде в концентрации 100–200 Е/мл, позволяет избавиться от посторонней чувствительной к нему микрофлоры.
  • Целлюлоза как субстрат для цитофагДля получения накопительных культур цитофаг, разлагающих целлюлозу, на поверхность основного минерального агара помещают кусочки фильтровальной бумаги. На бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранжевой или розовой окраски, а также за процессом лизиса бумаги.

Биологические методы включают использование специфических хозяев выделяемого микроорганизма, а также преимуществ некоторых свойств патогенных микроорганизмов. К ним относятся такие методы как:

  • Получение накопительной культуры бактерий, патогенных для животных организмов.Патогенные для животных бактерии можно выделить, заражая восприимчивое животное-хозяин смешанной культурой исследуемого материала, в котором предполагается его присутствие. В инфицированном животном патогенный микроорганизм часто преобладает и обнаруживается в крови и тканях в виде чистой культуры. При этом в результате действия защитных механизмов животного рост непатогенных сопутствующих микроорганизмов ингибируется, и они гибнут. Например, чистую культуру пневмококков можно получить через 4–6 часов после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей Streptococcus pneumoniaе. Пробы перитонеальной жидкости берут из брюшинной полости животного с помощью стерильной остроконечной капиллярной пипетки.
  • Симбиоз растений с Rhizobium. Клубеньки, образуемые на корнях бобовых растений, представляют собой природную накопительную культуру симбиотических азотфиксирующих бактерий. Корни бобовых растений, содержащие клубеньки, промывают и отделяют часть корня с клубеньками. После поверхностной стерилизации корень помещают в воду, раздавливают пинцетом в одной чашке Петри, 1–2 петли такой суспензии переносят в следующую чашку и т. д. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный агар с маннитом. После застывания агара чашки инкубируют при оптимальной температуре.

Во многих случаях для получения накопительной культуры определенных бактерий используют сочетание физических, химических и биологических методов.

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений).

Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы.

Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

  • на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;
  • шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;
  • точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;
  • засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде.

Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым. Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В, а после очередной стерилизации – в направлении Г. Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты.

Важно

Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Источник: https://vseobiology.ru/mikrobiologiya/1778-23-chistye-kultury-mikroorganizmov-metody-polucheniya-i-naznachenie

Презентация на тему “Выделение чистых культур. Идентификация”

  • Скачать презентацию (4.12 Мб)
  • 19 загрузок
  • 4.0 оценка

ВКонтакте

Одноклассники

Facebook

Твиттер

Телеграм

Ваша оценка презентации

Оцените презентацию по шкале от 1 до 5 баллов

Презентация для школьников на тему “Выделение чистых культур. Идентификация” по медицине. pptCloud.ru — удобный каталог с возможностью скачать powerpoint презентацию бесплатно.

  • Формат pptx (powerpoint)
  • Количество слайдов 22
  • Слова
  • Конспект Отсутствует
  • Слайд 2 РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ НА ЖИДКИХ И ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.ФАЗЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем, их колонии образуются через 18—20 ч, либо через 3—5 нед. соответственно.
    2
  • Слайд 3 Время культивирования
    3
  • Слайд 4 1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды. 2. Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. 3. Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда. 4. Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки. 4
  • Слайд 5 I этап (нативный материал) Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). Посев на плотные питательные среды (получение колоний). II этап (изолированные колонии) Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке (морфологические свойства бактерий). Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры. III этап (чистая культура) Определение культуральных, морфологических, биохимических и других свойств для идентификации культуры бактерий
    5
  • Слайд 6 Культуральные свойства:
    Характеристика колоний микроорганизма
    6
  • Слайд 7 1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды; 2 — очертания колоний; 3 — характер края колоний; 4 — внутренняя структура колоний.
    7
  • Слайд 8 а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем;ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная;л – концентрическая; м – сложная
    8
  • Слайд 9 а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый;
    ж – каплевидный; з – конусовидный
    9
  • Слайд 10 а – гладкий; б – волнистый; в – зубчатый;
    г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый;
    ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и – ветвистый
    10
  • Слайд 11 Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением окрашивающего вещества в среду либо окраской самих бактерий. Среди пигментов преобладают жёлтые, оранжевые и красныекаротиноидные пигменты. Пигменты бактерий — вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами, обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratiamareescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы. Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован, поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия.
    Пигменты: 1.участвуют в метаболизме бактерий, 2.повышают их устойчивость к химическим веществам, 3. защищают бактерии от действия видимого света и УФ-лучей. Мутанты, лишённые способности к пигментообразованию, быстро погибают на свету. Искусственно окрашенные бактерии (например, метиленовым синим) также проявляют повышенную лабильность к инсоляции. Бактерицидное действие солнечного света проявляется в присутствии кислорода и обусловлено фотоокислением. При этом клеточные пигменты (флавины и цитохромы) действуют как катализаторы. Каротиноиды ингибируют этот процесс. У некоторых бактерий образование пигментов происходит только на свету (например, каротиноидов у туберкулёзной палочки).
    Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между пигментацией и образованием вторичных метаболитов существует такая тесная корреляция, что при наличии пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других БАВ.
    11
  • Слайд 13 определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту микроорганизмов Выявляют посевами на дифференциально-диагностические среды
    13
  • Слайд 14
    Энзимы – специфические белки, которые катализируют химические реакции. Классификация ферментов бактерий: По типу катализируемой реакции – оксиредуктазы, лиазы, трасферазы, гидролазы и т.д. По локализации – эндоферменты – катализируют реакции внутри клетки. Экзоферменты – выделяются из бактериальной клетки, катализируют расщепление Генетический контроль образования – конститутивные (в течение всего жизненного цикла, не влияет наличие субстрата), индуцибильные – они образуются в ответ на наличие субстрата По субстрату – протеолитические – расщепляют белки, сахаролитические – расщепляют углеводы, липолитические – расщепляющие жиры.
    14
  • Слайд 15 расщепляют белки до аминокислот, мочевины, индола, сероводорода, аммиака. По выделению этих продуктов на средах с белком выявляют наличие протеаз. Среды:
    С желатином, разжижение среды На свернутой сыворотке по ее разжижению На молоке по его просветлению
    Казеин – будет разрушаться, белок свертываться. На МПБ по выделению газа индола и сероводорода, которые выявляют с помощью индикаторных бумажек
    15
  • Слайд 16 1 – формы разжижения желатина; II – определение сероводорода; III – определение индола: 1 – отрицательный результат; 2 – положительный результат
    16
  • Слайд 17 представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами и покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером — водным раствором поливинилового спирта.
    17
  • Слайд 18 расщепляющие углеводы Эти ферменты расщепляют углеводы до альдегидов, кислот, углекислого газа и H2. Для их определения используют МПБ или МПА, к которым добавляют индикатор кислотообразования + углевод + поплавок для газообразования. Пример – среды Гисса. Если свет среды меняется, выделяется газ, значит идет расщепление углеводов (моносахара). На этом принципе создаются панели, планшеты, бумажные индикаторные системы и приборы для учета ферментативной активности. 18
  • Слайд 20 – липазы – выявляют на ЖСА – желточно- солевой агар, который содержит желток, разрушение липидов желтка сопровождается помутнением среды 20
  • Слайд 21 Микробиологический анализатор Multiskan FC Позволяет идентифицировать более 500 видов микроорганизмов и патогенных грибов. Система микробиологической диагностики включает оценку данных, полученных в результате проведения исследований по идентификации микроорганизмов и определении их антибиотикочувствительностиinvitro, и коррекцию их на основании сведений о природной устойчивости или чувствительности отдельных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также сведений о корреляции данных по чувствительности, полученных invitro, клинической эффективности антибактериальных препаратов. 21
Читайте также:  Какова роль бактерий для йогурта и как приготовить этот продукт дома?

Посмотреть все слайды

Источник: https://pptcloud.ru/medicina/5-vydelenie-chistyh-kultur-identifikatsiya

Реферат: Принципы и методы выделения чистых культур. Ферменты бактерий, их идентификация. Внутривидовая идентификация (эпидемиологическое маркирование)

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевает­ся потомство бактерий, возникающее в результате размно­жения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обяза­тельным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических культуральных, биохимических и антигенных свойств, по со­вокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение по­лучил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине пита­тельной среды.

Очень широко применяются элективные питательные сре­ды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных.

При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если матери­ал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой.

При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза.

Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для
взятия бактериальной петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо.

Совет

После вынима­ния пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой.

При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами.

Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. За­тем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находяще­гося на ней материала. Линию посева начинают с того ме­ста, в котором находится материал.

Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов.

Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользо­ваться вместо петли тампоном или шпателем.

Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объ­ективом малого увеличения и с суженной диафрагмой.

Обратите внимание

Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Величинаколонии определяется ее диаметром, В за­висимости от диаметра различают колонии точечные (диа­метр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная — круглая, непра­вильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоми­нающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контура края определяют при рассмотре­нии колонии под лупой или микроскопом с малым увеличе­нием. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные (фестончатый, волнистый, бахромчатый).

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии нево­оруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают (каплеобразные, куполообразные, конусообразные, колонии с вдавленным центром, плоские).

Поверхностьколо­ний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозна­чают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый».

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации.

Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также при попадании микроба во внешнюю среду.

Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов.

Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны.

Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные идр.

Структура колоний определяется в проходящем све­те при слабом увеличении микроскопа.

По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.

Консистенцию колонии исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей.

По характеру консистенции колонии бывают:

1) пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

На жидких питательных средах характер роста мик­робов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бак­терий.

Источник: https://ronl.org/referaty/biologiya/843387/

Ссылка на основную публикацию