Основные методы лабораторного выявления бактерий

Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

Вбактериологии для обнаружения возбу­дителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического ме­тода являются его простота, быстрота, эконо­мичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологи-

ческих или тинкториальных особенностей возбудителя и при достаточном его содержа­нии в исследуемом материале. Как правило, этот метод является ориентировочным.

Основной, самый точный метод диагностики бактериальных инфекций — бактериологичес­кий, который используют почти при всех забо­леваниях, несмотря на такие его недостатки, как длительность исследования (от 4—5 дней до 2 месяцев), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительная дороговизна.

Идентификацию выделенной чистой культу­ры производят по морфологическим, тинкто-риальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в за­висимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя.

С целью эпидемиологическо­го маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: опреде­ляют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как прави­ло, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике за­болеваний, вызванных условно-патогенны­ми микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является опреде­ление количества возбудителей в исследуемом материале.

Биологический метод не экономичен, не гуманен и поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, мор­ских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Постановка диагноза инфекционного забо­левания возможна также с помощью серологи­ческого метода, направленного на обнаруже­ние либо специфических антител в сыворот­ке больного, либо специфических антигенов непосредственно в исследуемом материале.

Антитела к возбудителю заболевания появ­ляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в пер­вые дни заболевания является самым большим недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро.

Кроме то­го, при многих болезнях требуется изучение антителообразования в динамике и выявле­ние увеличения количества антител, что так­же не разрешает быстро поставить диагноз.

В насто­ящее время при ряде болезней определяют не только количество иммуноглобулинов, но и их принадлежность к различным классам.

При некоторых заболеваниях серологичес­кий метод применяют для выявления спе­цифических антигенов в исследуемом мате­риале.

Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического ме­тода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспресс-диагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

Особенности диагностики анаэробных ин­фекций.Для микробиологической диагности­ки анаэробной инфекции используют бакте-риоскопический и бактериологический методы. Серологический метод имеет ограниченное практическое применение из-за отсутствия коммерческих наборов диагностикумов. Для экспресс-диагностики применяется ГЖХ.

Бактериоскопический метод при диагностике анаэробной инфекции имеет незначительную информативность, поскольку анаэробы мор­фологически не отличаются от аэробных мик­роорганизмов, кроме тех редких случаев, когда анаэробы имеют характерную морфологию.

Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, дорого и трудоемко. Окончательный ответ получают через 7—10 дней с момента забора исследуемого материа­ла. Посев производят на кровяные среды, обо­гащенные факторами роста (гемин, менадион, редуцирующие добавки).

Посевы инкубируют в анаэробных условиях в анаэростатах или перчаточных боксах. Идентификацию выде­ленных чистых культур проводят на основании изучения культуральных, морфологических и тинкториальных свойств и ферментативной активности.

Антигенные свойства анаэробов изучают редко из-за отсутствия коммерческих наборов диагностических сывороток.

Под анаэробной микробиологической техникой понимают комплекс приемов и мето­дов, позволяющих в бескислородных условиях обеспечить доставку материала в микробиоло­гическую лабораторию, выделение и иденти­фикацию анаэробов.

С этой целью используют специальное лабораторное оборудование: анаэ­робные рабочие станции (перчаточные боксы), анаэростаты, инертный газ или газогенератор­ные системы, вакуумный насос, индикаторы анаэробиоза, транспортные среды, элективные питательные среды для анаэробов и тест-систе­мы для их идентификации.

Для транспортировки образцов, предназначенных для исследования на анаэробы, используют флаконы с транспортными средами, создающие анаэробные условия при транспортировке.

Для создания анаэробиоза в анаэростате откачи­вают воздух и после трехкратной вакуум-замести­тельной промывки анаэростаты заполняют бескисло­родной трехкомпонентной газовой смесью газом из баллона.

Можно использовать и химическое связы­вание свободного кислорода.

Для этого используют газогенераторную систему, содержащую борогидрит и бикарбонат натрия, в которой при добавлении во­ды происходит химическая реакция, протекающая со связыванием свободного кислорода и выделением углекислого газа и водорода.

Для контроля анаэробиоза в процессе инкубации по­севов используют индикаторы анаэробиоза — резазурин или метиленовую синь. В анаэробных бескислородных

условиях индикатор анаэробиоза находится в восстанов­ленной бесцветной форме, а при наличии кислорода — в окисленной окрашенной. Резазурин окрашивается в ро­зовый цвет, а метиленовая синь — в голубой.

При наличии в лаборатории большого объема ана­лизов целесообразно применение анаэробных рабо­чих станций, которые представляют собой защитный бокс 3-го класса (изолирующий) и являются газонеп­роницаемыми конструкциями, заполненными бес­кислородной газовой смесью.

Культуры, выросшие только в аэробных условиях, но не давшие роста в ана­эробных условиях, рассматривают как аэробы; культуры, выросшие одновременно в аэроб­ных и анаэробных условиях, рассматривают как факультативные анаэробы и в дальнейшем их идентифицируют по общепринятым схе­мам.

Культуры, не выросшие в аэробных усло­виях, но давшие рост в анаэробных условиях, рассматривают как облигатные анаэробы и приступают к их идентификации.

Идентификацию анаэробов проводят в два этапа. На первом этапе идентификации ориентировочно определяют родовую принадлежность изолирован­ных анаэробных культур. На втором этапе проводят окончательную идентификацию до вида по биохими­ческим тестам, антигенным свойствам и по изучению конечных продуктов бактериального метаболизма в среде культивирования с помощью метода ГЖХ.

При идентификации анаэробов до рода учитывают­ся культуральные, морфологические и тинкториаль-ные свойства, а также фенотипы исследуемых культур по отношению к анаэродискам. Анаэродиски — это диски, пропитанные антибиотиками, желчью и брил­лиантовым зеленым.

Обычно используют следующие анаэродиски: канамицин — 1000 мкг/мл, пеницил­лин — 2 ЕД, полимиксин В — 100 ЕД, эритроми­цин — 60 мкг/мл, рифампицин — 15 мкг/мл, ристо-мицин — 5 мкг/мл, желчь — 5 мг/мл и диск с брил­лиантовым зеленым — 100 мкг.

Ориентировочную родовую идентификацию проводят, сравнивая полу­ченный фенотипический профиль с таблицей фено-типических профилей анаэробных микробов.

Зная ориентировочную родовую принадлежность анаэробного микроба, его вид определяют с помо­щью биохимических тестов, а в случае необходи­мости — и по конечным продуктам бактериального

метаболизма, выделяемым в среду культивирования с помощью ГЖК-метода.

Газовая хроматография. Бактериологическое исследование на анаэробы длительно, тру­доемко и дорого.

Это обусловлено медленным ростом, а также необходимостью изучения многочисленных таксономических признаков при идентификации выделенных чистых культур.

Использование метода ГЖХ для экспресс-диагностики анаэробной инфекции осно­вано на хроматографическом определении в исследуемом материале специфических продуктов метаболизма анаэробов — лету­чих жирных кислот, которые служат метабо­лическими маркерами наличия анаэробов.

Конечными высокоспецифичными продук­тами метаболизма углеводов у анаэробов яв­ляются жирные кислоты. Различают корот-коцепочечные или летучие жирные кислоты С2-С7 и длинноцепочечные нелетучие кис­лоты.

При этом метаболическими маркерами анаэробов являются изомасляная и масляная, изовале-риановая и валериановая, изокапроновая и капроновая, гексановая и каприловая кис­лоты. Аэробные бактерии летучие жирные кислоты не продуцируют.

Для хроматографического анализа проводят экс­тракцию летучих жирных кислот эфиром или другими летучими органическими растворителями. Экстракт вводят в хроматограф. Чувствительность метода — Ю-6 г/л; время анализа — 30-50 мин.

Идентификацию летучих жирных кислот осуществляют по относи­тельному времени удерживания, для сравнения ис­пользуют аналитические стандарты жирных кислот.

Для получения более подробной информации о метаболической активности анаэробов определяют длинноцепочечные жирные кислоты, которые пере­водят в летучие производные, например метиловые эфиры, многоатомные спирты, ароматические соеди­нения, углеводные соединения, аминосахара, ами­нокислоты, пурины и т.

п. Наличие в исследуемом материале длинноцепочечных жирных кислот также является убедительным доказательством анаэробной природы воспалительного процесса. Анализ метило­вых эфиров жирных кислот необходим, если в пробе отсутствуют летучие жирные кислоты или определя­ется только одна уксусная кислота.

Наличие в исследуемом материале только уксус­ной или пропионовой кислоты не может служить достоверным доказательством наличия анаэробов, так как эти кислоты могут продуцироваться неко­торыми факультативными анаэробами, такими как Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp. Обнаружение в патологическом мате­риале только молочной или яблочной жирных кислот также не может быть веским доказательством нали­чия анаэробов, так как эти кислоты являются нор­мальными метаболитами тканей человека.

Очень важное значение при индикации ана­эробов в патологическом материале приоб­ретают ложноположительные и ложноотрица-тельные результаты ГЖХ-анализа.

Под ложно-положительными результатами ГЖХ-анализа понимают такие результаты, когда на хрома-тограмме присутствуют пики жирных кислот, а бактериологически облигатные анаэробные бактерии не выделяются.

Под ложноотрица-тельными результатами ГЖХ-анализа понима­ют такие результаты, когда на хроматограмме отсутствуют пики жирных кислот, хотя анаэ­робы присутствуют в изучаемой пробе и могут быть выделены бактериологически.

Причины ложных результатов ГЖХ-анали­за при исследовании на анаэробы приведены в табл. 15.2.

Источник: https://pdnr.ru/a11261.html

Методы микробиологической диагностики

Содержание:

1. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………2

1. Организация лабораторной микробиологической службы..2

1. Принципы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний……………………………………………4

1. Методы выделения и идентификации бактерий…………………5

1. Методы идентификации нуклеиновых кислот…………………19

1. Методы обнаружения вирусов…………………………………………23

1. Методы дианостики грибковых инфекций……………………….27

1. Методы обнаружения простейших…………………………………..29

1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………….30

Литература……………………………………………………………………………………31

Введение

Микробиологическая диагностика в первую очередь необходима для определения причины инфекционных заболеваний. Существует 5 основных методов лабораторной диагностики: микроскопический, бактериологический, биологический, серологический и аллергический. Их принципы мы и рассмотрим в данном реферате.

Также рассмотрим вопросы организации лабораторной микробиологической службы, методы выделения и идентификации бактерий, обнаружения вирусов, грибов и простейших.

Данная тема очень актуальна в наше время, так как с развитием общества и с увеличением численности населения все более масштабным становится распространение инфекций и своевременное обнаружение их носителей способно предотвратить возникновение эпидемий.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ

Объект изучения медицинских микробиологических лабораторий патогенные биологические агенты (ПБА) патогенные для человека микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы, простейшие), генно-инженерно модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также материал (включая кровь, биологические жидкости и экскременты организма человека), подозрительный на содержание ПБА. В зависимости от выполняемых исследований, микробиологические лаборатории подразделяют на диагностические, производственные и научно-исследовательские. В соответствии с типами микроорганизмов, изучаемых в них, выделяют бактериологические, вирусологические, микологические и протозоологические лаборатории. С возбудителями инфекционных заболеваний работают только в специализированных лабораториях, обеспечивающих безопасность её персонала и невозможность утечки патогенных микроорганизмов за пределы лаборатории.

Группы возбудителей инфекционных заболеваний

Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четыре группы возбудителей.

Группа I: возбудители особо опасных инфекций: чума, натуральная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др.

Группа II: возбудители высококонтагиозных бактериальных грибковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, бластомикоз, бешенство и др. В эту группу также включён ботулотоксин (но не сам возбудитель ботулизма).

Группа III: возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выделенных в отдельные нозологические формы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.). В эту группу также включены аттенуированные штаммы бактерий групп I, II и III.

Группа IV: возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемии, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллёза, амебиаза, аденовирусы, герпесвирусы и др.).

Лаборатории разных групп риска

В зависимости от уровня безопасности работы с микроорганизмами лаборатории подразделяют на четыре группы риска.

Первая группа риска: лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском.

Вторая группа риска: режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким общественным риском.

Третья группа риска: базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограниченным общественным риском.

Четвёртая группа риска: базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общественным риском.

Бактериологические лаборатории

В системе Министерства здравоохранения и Государственного комитета санитарно-эпидемиологическ�

Источник: https://www.studsell.com/view/80791/

Методы обнаружения микроорганизмов в воде

Для обнаружения микроорга­низмом в воде и других биосубстратах и определения их количества могут быть использованы бактериологическийи микроскопическийметоды.

Основные этапы бактериологического исследования:гомогенизация образца, десорбция микроорганизмов с плотных частиц, приготовле­ние разведений, посев на питательные среды, идентификация выде­ленных культур.

Гомогенизациюобразца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании жидких, плот­ных, сыпучих продуктов, в зависимости от характеристик испытуе­мого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбциябактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов твёрдой консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки.

При суспензировании к навеске образца массой 10 г добавляют 90 см3 воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе).

Общие колиформные бактерии – грамотрицательные, оксидазонегативные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +37 °С в течение 24-48 ч.

Термотолерантные колиформные бактерии – входят в состав ОКБ и обладают всеми их признаками, но ферментируют лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +44 °С в течение 24 ч.

Сульфитредуцирующие клостридии– спорообразующие анаэроб­ные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия в условиях культивирования на железо-сульфитном агаре при температуре 44 °С в течение 16-18 ч.

Коли-фаги– бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре 37 °С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Санитарно-показательные микроорганизмы, характеризующие загрязнение почвы.

Общее количество бактерий – количество микроорганизмов, образующих колонии на МПА при температуре 37 °С в течение 24 ч, – суммарный показатель микробиологического загрязнения почвы микрофлорой преимущественно фекального происхождения.

Термофильные микроорганизмы – микроорганизмы, образующие колонии на МПА при температуре 60 °С в течение 24 ч, – показатель загрязнения почвы компостом или навозом. Почвы, показывающие высокое содержание кишечных палочек и низкое – термофилов, считают фекально загрязнёнными.

БГКП– грамотрицательные не образующие спор короткие палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 ч, не обладающие оксидазной активностью.

Перфрингенс-титр – титр грамположительных облигатно-анаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие Clostridium perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Аммонификаторы – микроорганизмы, превращающие азот в катионы аммония. Аммонификация (гниение) белков – результат деятельности гнилостной микробиоты (актиномицеты, грибы, анаэробные бациллы). Высокое содержание в почве этой микробиоты свидетельствует о присутствии органических веществ.

Нитрификаторы – микроорганизмы, окисляющие азот из солей аммония в нитраты и нитриты. К этой группе относятся представители родов Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosobacter. Их присутствие свидетельствует о наличии органического загрязнения и активно идущих процессах самоочищения.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы – почвенная микробиота, использующая целлюлозу в качестве источника углерода. В этой группе велика роль неспоровых бактерий, базидиальных, дрожжеподобных и несовершенных грибов.

Общая численность сапрофитов – количество микроорганизмов образующих колонии на МПА при температуре 28-30 °С в течение 72 ч. Высокая численность сапрофитной микробиоты свидетельствует об органическом загрязнении почвы.

Патогенные микроорганизмы – сальмонеллы (Salmonella spp.), патогенные клостридии (С. tetani, С. botulinum), возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis), вирусы.

З А Н Я Т И Е11

Дата ______________

Тема: Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы (2 день). Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

План занятия:

1. Знакомство с микрофлорой человеческого тела. Регистрация результатов посева отпечатков пальцев и слизи из зева.

2. Провести регистрацию результатов посева воздуха седиментационным методом Р. Коха.

3. Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

Методические указания

1.Сосчитать количество колоний, выросших на МПА и среде Эндо из посевов отпечатков пальцев, особо обратив внимание на колонии кишечной палочки на среде Эндо. Промикроскопировать при ок­раске по Граму несколько колоний со среды Эндо и МПА.

Промикроскопировать колонии, выросшие при посеве слизи из зева (окраска по Граму). Результаты работы оформить в виде протокола.

Источник: https://megaobuchalka.ru/1/1777.html

Микробиология – Методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится в трех основных направлениях:

1) поиски возбудителя заболевания в материале, взятом у больного (испражнения, моча, мокрота, кровь, гнойное отделяемое и др.);

2) обнаружение специфических антител в сыворотке крови — серологическая диагностика;

Для выявления возбудителя инфекционного заболевания и его идентификации (определения вида возбудителя) используют три метода: микроскопический, микробиологический (бактериологический) и биологический.

Микроскопический метод позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в материале, взятом у больного. Этот метод имеет решающее значение при диагностике гонореи, туберкулеза, заболеваний, вызываемых простейшими: малярии, лейшманиозов, балантидиаза, амебиаза.

Возможности микроскопического метода при этих инфекциях обусловлены значительными морфологическими различиями возбудителей данных заболеваний. Особенности морфологии возбудителей играют основную роль в постановке диагноза.

Однако микроскопический метод не позволяет поставить диагноз при таких инфекциях, как, например, брюшной тиф и паратифы, дизентерия, потому что различить их возбудителей по морфологическим признакам невозможно (все они грамотрицательные палочки).

Для того чтобы различить сходные между собой по морфологии микроорганизмы, их надо получить в чистой культуре и идентифицировать, что можно сделать с помощью микробиологического (бактериологического) метода исследования.

Микробиологический метод заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации.

Окончательную принадлежность выделенной культуры к определенному виду (типу) микроорганизмов устанавливают после изучения антигенной структуры, используя различные иммунологические реакции (агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.).

Если возбудители инфекционных заболеваний (риккетсии, вирусы, некоторые простейшие) не растут на искусственных питательных средах или необходимо выделить возбудителя из микробных ассоциаций, то используют метод заражения восприимчивых животных биологический.

Биологический метод осуществляют путем выделения возбудителя заболевания или его токсина при заражении лабораторных животных, восприимчивых к данному заболеванию.

Диагноз устанавливают по воспроизведению у животного типичной картины заболевания и по выделению чистой культуры возбудителя из различных органов путем посева на питательные среды в случае заражения животного микробными ассоциациями.

Идентификацию выделенного возбудителя проводят до вида (типа), используя бактериологический метод. Биологический метод используют также при определении вирулентности возбудителей.

Серологические методы диагностики инфекционных заболеваний основаны на выявлении специфических иммунных антител в сыворотке крови больного.

Для этого используют различные иммунологические реакции: реакцию агглютинации при брюшном тифе (Видаля), реакцию Райта при бруцеллезе, реакцию связывания комплемента (Вассермана) при сифилисе, реакцию непрямой гемагглютинации при многих инфекционных заболеваниях, реакцию нейтрализации и торможения гемагглютинации при вирусных заболеваниях.

Аллергический метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью аллергических проб — накожных и внутрикожных. Метод выявляет повышенную чувствительность замедленного типа, возникающую в организме при многих инфекционных заболеваниях. Введение аллергена накожно или внутрикожно используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза и других заболеваний.

Для того чтобы правильно поставить диагноз инфекционного заболевания, чаще всего используют комплекс всех лабораторных методов: выделение возбудителя, определение антител в крови больного и выявление повышенной чувствительности замедленного типа.

Источник: http://microbiology.ucoz.org/index/metody_mikrobiologicheskoj_diagnostiki_infekcionnykh_zabolevanij/0-112

Общие принципы диагностики в медицинской микробиологии, оценка результатов лабораторного исследования

ГЛАВА II. ОСНОВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ микроОрганизмов

2.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Главным методом диагностики в настоящее время остается бактериологический, состоящий из выделения чистой культуры возбудителя и определения его признаков.

Микроскопический метод выявляет бактерии только в случае нативного содержания в материале 105 и более бактерий на мл и из-за близости морфологии бактерий позволяет отнести выявленную культуру только к крупным таксонам (грам(+), грам(-), бактерии, кокки, спирохеты и др.

) Его результаты могут быть использованы для выбора питательных сред и предварительного суждения о возможном возбудителе.

Введение в практику ИФА, проточной цитометрии бактерий и иммунофлуоресцентного метода расширило возможности микроскопического метода, но и в этом случае он не может заменить бактериологический метод, поскольку не позволяет установить чувствительность возбудителя к химиопрепаратам и ряд других свойств для установления источника инфекции. При идентификации грибов и простейших возможности микроскопического метода значительно шире.

Генетические методы.

Внедренные в последнее время в лабораторную практику методы ДНК-гибридизации, цепной полимеразной реакции (ЦПР), несмотря на большую специфичность и высокую чувствительность около 10 микроорганизмов в мл или грамме исследуемого материала, обладают целым рядом недостатков, среди которых надо отметить более высокую стоимость одного определения, техническую и методическую сложность. Однако за генетическими методами, особенно ЦПР, будущее.  

Серологический метод имеет вспомогательное значение, так как с его помощью нельзя установить спектр и уровень активности антимикробных препаратов по отношению к возбудителю болезни и провести внутривидовое типирование. Ограничивают его возможности выраженная мозаичность антигенной структуры многих условно-патогенных микробов, наличие антител против них у здоровых людей и слабая выраженность иммунного ответа на антигены условно-патогенных микробов. При хронических и затяжных формах заболевания роль в диагностике возрастает. Серологические реакции ставятся обычно с аутокультурой, результат оценивается по нарастанию титра антител в процессе болезни более чем в 4 раза.

Экспериментальный метод или метод биопробы – основан на неодинаковой чувствительности разных лабораторных животных к определенным микроорганизмам (животных определенного вида, возраста и массы тела заражают чистыми культурами или исследуемым материалом). Как правило, при диагностике условно-патогенной флоры не используется из-за неспецифичности клинической картины, вызываемой этими микробами.

Аллергический метод – основан на постановке кожно-аллергических проб. Применяют для выявления гиперчувствительности к различного рода антигенам (аллергенам) при диагностике инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез и др.) На диагностическую ценность кожно-аллергических проб при заболеваниях, вызванных условно-патогенной флорой, существуют противоположные точки зрения. Одна – не применяется в связи с наличием сенсибилизации к представителям нормальной микрофлоры и связанной с этим малой специфичностью. Другая – может служить как критерий диагноза при хронических инфекциях, которые всегда сопровождаются аллергизацией макроорганизма.

Бактериологический (культуральный) метод. При использовании этого метода следует учитывать, что в патологическом материале от больного, как правило, присутствует ассоциация микроорганизмов, которая может включать возбудителей заболевания, заносные из других тканей и внешней среды виды, микробы, попавшие в материал при его заборе и доставке. Популяции возбудителей при этом выражено гетерогенны, изменчивы и их количественный состав варьирует у разных больных и меняется в процессе болезни, особенно при использовании антибактериальных препаратов. Интересы химиотерапии требуют определения чувствительности культур к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам, эпидемиологического анализа – фаговара, биовара, серовара и др. С целью определения смены возбудителей и изменения их свойств материал из открытых процессов исследуется каждые 5-7 дней.

Установленным является факт выраженной внутри- и межпопуляционной изменчивости условно-патогенных микробов. Представления о гетерогенности популяций микробов диктуют необходимость: а) резкого увеличения выборки (числа исследуемых культур одного вида) в процессе микробиологической диагностики; б) ориентации при выборе химиотерапевтических средств на варианты и штаммы возбудителя, обладающие наиболее широким спектром и наиболее высоким уровнем устойчивости к антибиотикам и антисептикам; в) динамичного наблюдения за количественными и качественными изменениями в составе популяции возбудителя и соответствующей изменениям коррекции схемы лечения; г) предупреждения суперинфекции патологических процессов как путем их герметизации (создания безмикробной среды), так и резкого снижения массивности микробной контаминации объектов больничной среды, с помощью которых происходит суперинфекция.

Межпопуляционная изменчивость условно-патогенных микробов проявляется в формировании и широком распространении в больничных стационарах госпитальных штаммов и эковаров, обладающих большей устойчивостью к антимикробным факторам больничной среды и элиминирующим факторам организма человека.

Принципы микробиологической диагностики условно-патогенных микроорганизмов

1)   выявление и идентификацию возбудителя инфекции у больного до вида (при невозможности до рода);

2)   определение чувствительности выделенного микроорганизма к антимикробным препаратам;

3)   выбор рациональной антимикробной терапии на основе результатов лабораторного анализа.

Диагностические исследования, проводимые при заболеваниях, вызванных

Источник: https://vunivere.ru/work85673

При микробиологическом изучении количественного состава микрофлоры предполагают, что то малое количество материала, которое обычно используется в анализах, должно обеспечивать достаточно точную микробиологическую характеристику всего объекта. С этой целью отбирается средняя проба.

Отбор проб для анализа, предполагающего микробиологические исследования, ведется в целом по принципу обычного отбора средней пробы. Однако выполняется он стерильно, с соблюдением правил асептики. Весь инвентарь предварительно стерилизуют. Чтобы избежать размножения микрофлоры, анализ проводят сразу после ее отбора.

Необходимо учитывать возможность очень неравномерного распределения микрофлоры в пищевых продуктах и других объектах. Так, в отстоявшемся свежем молоке основная масса микроорганизмов сосредоточивается в верхнем слое.

В вареных колбасах, взятых из магазина, следует ожидать большего числа микроорганизмов на оболочке и во внешнем слое и меньшего — в центральной части батона.

При анализе воды, отбираемой из крана, надо учитывать возможность накопления микрофлоры в трубах вблизи крана. Чтобы получить правильные результаты, следует некоторую часть воды слить, а анализу подвергнуть следующие порции.

Для плодов и овощей, у которых микрофлора сосредоточена на поверхности, удобно пользоваться смывами. Плоды помещают в заранее простерилизованный сосуд и в него же вливают определенное количество стерильной воды. После энергичного встряхивания в течение нескольких минут микроорганизмы оказываются смытыми в воду и она может использоваться для посевов.

При исследовании спецодежды и полотенец, прилавков, котлов и т. д. целесообразно воспользоваться трафаретом из проволоки с внутренней площадкой в 25 или 50 см2.

Все 12 тампонов собирают в пустую стерильную колбу и в нее выливают остатки воды, в которой их смывали. После встряхивания и десорбции микрофлоры с тампонов в воду ее подвергают исследованию.

Результаты анализа обычно относят к 1 г вещества, 1 мл жидкости, 100 см2 поверхности. Особенности анализа других объектов будут отмечены далее.

При выполнении работы необходимо строго учитывать количество материала, взятого для исследования, готовить разведения в точно отмеренном количестве воды и учитывать степень разведения при окончательном подсчете.

Могут быть исследованы воздух, поверхности рабочих столов, прилавка.

Из колбы после тщательного, но осторожного взбалтывания (чтобы не замочить ватную пробку) стерильной бактериологической пипеткой отбирают 1 мл жидкости и вносят в первую чашку Петри. Той же пипеткой еще 1 мл переносят во вторую колбу со 100 мл стерильной воды.

После взбалтывания этой колбы для равномерного распределения внесенного материала в воде из нее новой пипеткой отбирают 1 мл жидкости и вносят во вторую чашку Петри и затем второй же пипеткой — 1 мл в третью колбу.

Из нее после взбалтывания новой пипеткой отбирают 1 мл и вносят в третью чашку Петри.

После разливки материала сразу же необходимо в каждую чашку Петри внести теплый (около 45-50 °С) расплавленный МПА из заранее подготовленных пробирок. Более горячий агар использовать не следует, так как он вызовет гибель части микроорганизмов, что исказит конечные результаты анализа.

Агар с меньшей температурой также непригоден, так как быстро застывает.

Внесенная проба смешивается с питательной средой (МПА) осторожным покачиванием и легким вращением закрытой чашки. Все чашки для застывания среды оставляют на горизонтальной поверхности на 2-3 мин. После нанесения этикеток чашки, перевернутые вверх дном, помещают в термостат для выращивания, которое ведут при температуре 37 °С в течение 24 ч или при 22 °С в течение 48 ч.

При определении общего количества микроорганизмов в воздухе удобно воспользоваться методом оседания по Коху (седиментационный метод).

Чашки Петри, с мясопептонным агаром или суслом-агаром (последний для учета грибов) оставляют открытыми на 5-10 мин, а если воздух чистый,— в течение получаса. Ставят их на разном расстоянии от пола и в разных местах. Вместе с пылью и капельками влаги на поверхность агара оседают и микробы.

По истечении установленного времени чашки закрывают крышками, ставят их вверх дном и выдерживают при температуре 22 °С в течение 5 дней или при 40°С в течение 48 ч (для выращивания грибов — в течение 5-7 дней).

Допуская, что каждая колония выросла из одной микробной клетки, подсчитывают число бактерий в воздухе. На поверхность чашки площадью 100 см2в течение 5 мин оседает примерно столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Пользуясь этим методом, можно получить только приблизительное представление о содержании микробов, в воздухе, так как он не учитывает скорости движения воздуха и других факторов.

Пересчет количества микроорганизмов в исследуемом воздухе, полученного чашечным методом, не рекомендуется производить на количество микроорганизмов, содержащихся в единице объема воздуха, так как данные пересчета могут расходиться с действительным количеством микробов воздуха.

Подобным же образом можно исследовать микрофлору рук. Для этого левую или правую руку (ладони, пальцы, межпальцевые и подногтевые пространства) протирают стерильными ватными тампонами. Полученный смыв высевается на МПА в разведении 1/100 или 1/10000.

Бактериоскопический метод подсчета (метод отпечатков) применяется для оценки свежести мяса, однако может быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного состава микрофлоры других продуктов — рыбы, полуфабрикатов. Для оценки свежести мяса из пробы готовят три мазка-отпечатка: один — из поверхностного слоя с глубины 1-2 мм, другой — с глубины 2-2,5 см и третий — с глубины 3-3,5 см.

При изготовлении препарата-отпечатка из поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек 0,5-1 г и срезанной стороной прижимают для получения отпечатка и поверхности профламбированного и охлажденного предметного стекла.

Чтобы приготовить препарат-отпечаток из глубоких слоев, поверхность мяса сначала прижигают нагретым шпателем, затем стерильным скальпелем производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса и, прижимая к .

поверхности предметного стекла, делают отпечаток.

Мазки сушат на воздухе, фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют (можно окрашивать и обычным методом).

Окраска по Граму используется для оценки возможного присутствия, бактерий коли-тифозной группы, все представители которой грамотрицательны.

В соответствии с действующим на мясо ГОСТом результаты испытаний оцениваются следующим образом: мясо свежее, мясо сомнительной свежести и мясо несвежее.

Мясо свежее. В поле зрения в мазках-отпечатках, приготовленных из поверхностного слоя, обнаруживается небольшое количество микробов (единичные кокки и палочки), окрашенных грамположительно. В мазках из глубоких слоев микробы совсем не обнаруживаются или встречаются единичные клетки. На стекле нет следов распавшейся ткани мяса.

Мясо сомнительной свежести. В поле зрения в мазках, приготовленных из поверхностного слоя, обнаруживается несколько десятков микробов: в мазках из глубинных слоев — не более 20-30 бактерий с преобладанием кокковых форм. Заметны следы распада мышечной ткани.

Источник: http://alternativa-sar.ru/tehnologu/mikrobiologiya/v-n-azarov-osnovy-mikrobiologii-i-sanitarii/1449-metody-opredeleniya-kolichestva-mikroorganizmov

Диагностика инфекционных заболеваний

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:

1. бактериологические;
2. серологические;
3. метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне.

Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

• микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
• выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
• идентификацию бактерий;
• определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.).

Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в биологическом материале, а также дает предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов.

Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 – стрептококки;  2 – стафилококки;  3 – диплобактерии Фридленда;  4 – пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают.

Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры.

Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация  – это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма.

На бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.  Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов имеющих этиологическое значение для данного заболевания.

Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R – указывает на резистентность, I – умеренную чувствительность, S – чувствительность микроорганизма к данному препарату.

Оценка результатов исследования.  Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний.

В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания.

В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала.

Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 105, свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами.

Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител.

При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей.

В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания.

Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность – характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела.

IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами.

На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.

В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы.

Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал – сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д.

В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
• высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0.102 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов – 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0.105 копий/мл).

Источник: https://citilab.ru/articles/nauchno-metodicheskie-publikacii/diagnostika-infekcionnyh-zabolevanii.aspx