Особенности днк в клетках бактерий

Мобильная ДНК заставляет бактерии жертвовать собой

Горизонтальный перенос ДНК (то есть обмен молекулами ДНК между клетками) широко распространен среди бактерий и играет огромную роль в их эволюции. Ученые из Университета Лозанны (Швейцария) на примере двух видов бактерий из рода Pseudomonas уточнили механизм передачи мобильной ДНК от клетки к клетке.

Они проследили, в каких условиях бактерии передают друг другу фрагменты хромосом, содержащие целые группы генов, ответственные за определенный процесс, — так называемые «геномные островки». Для передачи такого элемента необходима активация фермента интегразы, который осуществляет вырезание соответствующего куска ДНК.

Фермент случайным образом включается только у 3–5% бактерий в популяции. Клетки, в которых он включился, плохо делятся и часто погибают. Они формируют специфические маленькие колонии, хорошо отличимые от колоний, образуемых нормальными клетками. Такую дифференцировку обеспечивает ген, названный shi («смерть»), содержащийся в геномном островке.

Таким образом, мобильная ДНК сама контролирует условия своей передачи.

Бактерии обладают огромным разнообразием фенотипов, что позволяет им жить практически где угодно. Это разнообразие обеспечивается способностью бактерий передавать куски ДНК, а вместе с ними и генетическую информацию, непосредственно от клетки к клетке.

Такой способ передачи информации называется горизонтальным переносом генов, в отличие от вертикального переноса, подразумевающего передачу от предков к потомкам.

Используя способность к горизонтальному переносу, клетка может поделиться с клеткой-соседкой геном, придающим устойчивость к антибиотику, или свойства вирулентности, или способность метаболизировать новое вещество.

Бактерии могут осуществлять не только внутривидовой обмен информацией, но и обмен между разными видами. Таким образом, горизонтальный перенос играет огромную роль в эволюции бактерий (подробней об этом см.

: В эволюции бактерий горизонтальный генетический обмен играет ту же роль, что и половое размножение у высших организмов, «Элементы», 09.04.2012). По оценкам, в геномах разных видов бактерий от 5 до 30% генетической информации появилось в результате горизонтального переноса. Возможен даже перенос генов от бактерий к эукариотам — например, агробактерии могут передавать плазмиды растениям).

Путей переноса генов существует несколько. Так, части бактериальной ДНК могут захватываться вирусами-бактериофагами и распространяться вместе с ними, см. трансдукция. Например, бактериофаги, инфицирующие морские сине-зеленые водоросли, могут переносить даже гены белков аппарата фотосинтеза.

Бактерии могут делиться друг с другом плазмидами — небольшими свободно плавающими в цитоплазме кольцевыми молекулами ДНК, которые в дополнение к бактериальной хромосоме кодируют белки, обеспечивающие различные адаптивные признаки .

Передача плазмидной ДНК осуществляется в основном при контакте двух бактериальных клеток в процессе конъюгации. Соответственно, плазмиды, которыми обмениваются бактерии, называются конъюгативными.

Важной особенностью плазмид является их способность реплицироваться, то есть создавать дочерние копии на матрице исходной молекулы.

Многие виды бактерий способны поглощать экзогенную ДНК — этот процесс называется трансформацией. Свободная ДНК может попасть в среду в результате лизиса, то есть гибели окружающих клеток. Некоторые виды способны выделять ДНК в среду активно при участии специальных белков.

Подробнее про горизонтальный перенос генов и способы, которыми он осуществляется, также можно прочитать в обзоре С. В. Шестакова «Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий» (PDF, 288 Кб).

Перенос генетической информации внутри клетки осуществляют инсерционные последовательности и транспозоны.

Транспозоны — мобильные элементы генома, которые могут вырезаться, реплицироваться и встраиваться обратно в других местах (часто в нескольких копиях); они перемещаются как целостная структура.

Разновидностей транспозонов очень много, и помимо аппарата для собственного размножения они могут содержать и что-то полезное для клетки. Особой разновидностью являются так называемые интегративные конъюгативные транспозоны (integrating and conjugative elements, ICE).

Эти мобильные фрагменты ДНК могут быть переданы другой клетке. Для этого они при определенных условиях выщепляются из генома клетки-хозяина (осуществляется ферментом интегразой), затем выщепленный участок закольцовывается, передается клетке-реципиенту путем конъюгации и встраивается не куда попало, а только по специфичным сайтам в геном реципиента путем сайт-специфичной рекомбинации. Эти фрагменты довольно большие и могут содержать большое количество генов.

Хорошо изученные геномные островки, обладающие свойствами ICE-элементов, описаны у Vibrio cholerae (возбудителя холеры), Haemophilus influenza (вызывает гемофильную инфекцию: бронхиты, менингиты и т. п.) и др.

Группа ученых из Университета Лозанны (Швейцария) изучает свойства ICE-элементов у широко распространенных бактерий из рода псевдомонад (Pseudomonas), обитающих в почве. В хромосоме у этих бактерий есть геномный островок, обладающий свойствами ICE-элемента.

Так как он содержит гены ферментов метаболизма некоторых ароматических веществ, в том числе хлорокатехола (chlorocatechol), его обозначают как ICEclc (см.: Marco Minoia et al., 2008. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas).

Он расположен после гена тРНК для аминокислоты глицина.

Ранее на примере бактерии Pseudomonas knackmussii было показано, что интеграза активируется только в небольшой фракции клеток, причем это происходит в стационарной фазе роста, когда питательные вещества в среде исчерпаны и рост популяции прекращается.

Для ее активации необходим белок InrR (integrase regulator) — регулятор интегразы (см.: Marco Minoia et al., 2008. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas). Он также синтезируется только в некоторых клетках в небольшом количестве.

Что определяет включение этих генов в клетках в составе популяции, неясно. Предполагается, что включение InrR и, соответственно, активация интегразы происходят стохастически (случайным образом), в результате некоторого «транскрипционного шума» в регуляторной области inrR.

В своей новой статье авторы проследили за судьбой отдельных клеток и процессом передачи ICEclc с помощью эпифлуоресцентной микроскопии с замедленной съемкой и показали, что клетки, в которых произошла активация интегразы, ведут себя иначе, чем остальные.

В эксперименте использовали два вида бактерий — Pseudomonas knackmussii в качестве донора ICEclc и Pseudomonas putida в качестве реципиента. Для того чтобы зафиксировать факт передачи ДНК, в  геном бактерий были внесены некоторые изменения (рис. 1).

Донорные клетки были помечены красным флуоресцентным белком (mCherry) путем встраивания копии кодирующего его гена в геном бактерий. Так как P. knackmussii содержит две копии ICEclc, в одной из них интегразу заменили на ген зеленого флуоресцентного белка (egfp) под контролем промотора интегразы (Pint).

Таким образом получилось, что красный белок синтезировали все клетки P. Knackmussii, а зеленый — только те, в которых активировалась интеграза. В результате наложения красного и зеленого активные доноры под микроскопом выглядят желтыми. Клетки-реципиенты содержали ген зеленого белка, перед которым не было регуляторного элемента, то есть сам по себе он не работал.

В результате эксперимента исследователи подтвердили, что только небольшая часть клеток в популяции (3–5%) может передавать генетическую информацию. Реципиенты могут получать ДНК только при прямом физическом контакте с активными донорами.

Однако способность передавать ДНК не приносит клеткам пользы. Активация ICEclc приводила к тому, что клетки при помещении на свежую питательную среду делились редко или вообще не делились и часто погибали.

Клетки с активной интегразой формировали отдельные микроколонии, хорошо отличимые от колоний нормальных клеток.

Изучив последовательность ДНК ICEclc, авторы обнаружили ген, ответственный за формирование микроколоний. Введение этого гена в клетки P. putida, не содержащие ICEclc, вызывало значительное замедление их роста. Ген назвали shi, что на японском означает «смерть».

Клетки, получившие копию shi, имели характерную вытянутую форму и формировали на питательной среде микроколонии.

После делеции этого гена из ICEclc интеграза в клетках по-прежнему могла активироваться и клетки могли передавать ДНК, однако процесс передачи происходил в пять раз реже.

Почему же носители активного ICE-элемента плохо себя чувствуют и редко делятся? Предполагается, что подготовка к процессу конъюгации требует от этих клеток большого количества ресурсов, которых негде взять в условиях истощенной среды, поэтому им буквально приходится занимать ресурсы у себя. Таким образом, клеткам приходится соблюдать баланс между самосохранением и эффективностью горизонтального переноса, которую обеспечивает «смертельный» ген shi. Функции этого гена пока неясны, однако понятно, что без него передача ДНК затруднена и что он портит клеткам жизнь.

У бактерий рода Enterococcus известно явление «готовности к передаче ДНК» (transfer competence), когда клетки, которые хотят получить плазмиду, стимулируют потенциальных доноров с помощью пептидных феромонов, но клеточной дифференциации при этом не наблюдается.

Однако так как элементы, подобные ICEclc, часто встречаются в бактериальных геномах, явление дифференциации клеток для горизонтального переноса наверняка широко распространено.

Описанный механизм заставляет вспомнить о концепции «эгоистичного гена» — мобильная ДНК буквально контролирует поведение клетки-хозяина, заставляя его идти на жертвы ради своего распространения.

Источник: Friedrich Reinhard, Ryo Miyazaki, Nicolas Pradervand, Jan Roelof van der Meer. Cell Differentiation to «Mating Bodies» Induced by an Integrating and Conjugative Element in Free-Living Bacteria // Current Biology. February 4, 2013. V. 23. P. 255–259. Doi: 10.1016/j.cub.2012.12.025.

См. также:
Marco Minoia, Muriel Gaillard, Friedrich Reinhard, Milos Stojanov, Vladimir Sentchilo, Jan Roelof van der Meer. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas (полный текст) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA

Источник: https://elementy.ru/news/431970

Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках E. coli

В связи с применением молекулярных векторов на практике, важно знать, насколько стабильны они в бактериальных клетках при многочисленных пересевах штамма.

Бактериальные внехромосомные молекулы ДНК характеризуются определенной степенью нестабильности, т.е. они не могут наследоваться бесконечно при делении клетки и не могут бесконечно сохранять свою генетическую структуру в неизменном виде.

Наиболее хорошо у прокариот изучена проблема нестабильности плазмид у E. coli.

Структурная нестабильность заключается в том, что плазмиды подвергаются спонтанным генетическим изменениям: (1) точечным заменам нуклеотидов, (2) делециям, (3) дупликациям, (4) инверсиям, (5) встройке элементов типа IS (insertion sequence) и Tn (транспозонов).

a) Обычно всякого рода мутации не дают плазмиде селективных преимуществ в размножении. Поэтому по преимуществу плазмиды без мутаций сохраняются в растущей бактериальной культуре. б) если же дают преимущества, то исходная плазмида будет постепенно вытесняться в культуре мутантной формой.

в) если наличие плазмиды снижает жизнеспособность, популяция будет постепенно обогащаться безплазмидными клетками.

Стабильность плазмиды определяется в основном ее генотипом.

Было обнаружено, что существуют специальные молекулярные механизмы распределения плазмид при делении клетки, при этом стабильность наследования не зависит от копийности плазмиды. Генетический локус (набор генов), ответственный за равномерное распределение плазмид при делении, был назван par (partition).

Например, в плазмиде pSC101 локус par находится возле локуса ori. Введение локуса par из pSC101 в менее стабильные плазмиды приводит к повышению их стабильности.

В F-плазмидах локус par включает несколько генов, кодирующих белки, участвующие в процессе разделения плазмид. Размер такого полного локуса par – 2.8 т.п.н. Один из его элементов служит для связывания плазмидных белков разделения и некоторых белков клетки-хозяина, и такой ДНК-белковый комплекс называется партисомой.

Как показали эксперименты по сохранности плазмид в клетках E.

coli, при длительных пересевах число плазмидсодержащих клетов убывает в виде плавной кривой, и после 300-350 клеточных делений клетки теряют плазмиды вовсе. Причем индивидуальные клоны E.

 coli различаются по темпам утраты плазмид (см. диаграмму). Плазмиды с большей копийностью поддерживаются «с большим успехом», т.е. начинают исчезать из части клеток после 200 делений.

Генно-инженерные элементы, снижающие стабильность плазмидных векторов:

а) наличие сильного промотора (интенсивная траскрипция может подавлять репликацию и снижать копийность плазмиды);

б) экспрессирующие векторные плазмиды, вызывающие сверхсинтез белка, часто приводят к утрате плазмиды или мутациям в ней;

Для поддержания штамма с плазмидой прибегают к методам атоселекции. Автоселекция плазмидсодержащих клеток – это культивирование их в таких условиях, когда клетки, теряющие плазмиду, лишены возможности размножаться. Например, по методу Мива и соавторов (1984) возможен отбор клеток на средах без антибиотиков:

В качестве бактерии-хозяина использован штамм E. coli со стрептомицинзависимым фенотипом (Smd). Целью эксперимента было маскировать этот фенотип (сделать его стрептомициннезависимым – Smi) с помощью плазмидного вектора. Для этого в состав вектора pBR322 встраивали хромосомную ДНК штамма E. coli, не имеющего фенотипа Smd. Вектором трансформировали E.

coli Smd, и отбирали клоны с фенотипом AprSmi. В результате был выделен ген rpsL, определяющей стрептомициннезависимый фенотип. Встройка этого гена в любой плазмидный вектор обеспечивает ее стабильное поддержание в штамме E. coli Smd на среде без стрептомицина.

Бесплазмидные клетки на такой среде не растут, а жизнеспособны только клетки, несущие гибридные плазмиды с геном rpsL.

Источник: https://students-library.com/library/read/26561-stabilnost-gibridnyh-molekul-dnk-v-kletkah-e-coli

Гены бактерий в ДНК человека

Ученые из Университета штата Мэриленд выяснили, что бактерии не просто способны обмениваться генетическим кодом с венцом творения, человеком, но занимаются этим успешно.

Оказывается, фрагменты бактериальных ДНК встречаются в геноме примерно у каждого третьего здорового землянина (из числа американцев, хотя бы), а в раковых клетках микробных генов на порядки больше.

Причем, разных.

Теперь исследователи в раздумье – то ли сами раковые клетки виноваты в том, что позволяют попадать в себя чужим генам, то ли бактериальный материал способствует перерождению здоровых органов человека в опухоли.

Руководитель исследования, доктор Джули Даннинг Хотопп рассказала, что ее команда нашла то, что искать не собиралась. Специалисты из Мэриленда изучали следы микробных ДНК в соматических клетках человека – тех, которые не формируют гамет.

Поработав с материалом, полученным от множества доноров ДНК, медики Дэвид Райли и Карстен Сайбер нашли более 7000 фрагментов бактериальных генов примерно у каждого третьего донора. В генотипе раковых клеток таких микробных “осколков” было обнаружено уже 690 000.

Например, в митохондриальной ДНК клеток острой миелоидной лейкемии более 30% генов заимствованы у создания под названием ацинетобактер.

Известно, что большинство случаев рака связаны с внедрением в здоровые клетки генетического материала вирусов. Пожалуй, бактерии в развитии онкологических заболеваний тоже принимают какое-то участие.

Если подтвердится предположение о том, что бактерии являются первичными в губительном процессе болезни, и их гены вызывают рак, можно было бы подумать о новых вакцинах. Лечить же подобные инфекции с помощью антибиотиков пока нереально.

Во-первых, медики не знают, откуда именно бактериальная ДНК берется в клетках “генетически модифицированного” человека, во-вторых, много бактерий, оставивших наследство в организмах пациентов, уже не реагируют на те антибиотики, которыми оперирует мировая медицина.

Источник здесь.

Источник: http://ecoblogger.in.ua/ru/content/geny-bakteriy-v-dnk-cheloveka

Генетика бактерий особенности генетики бактерий бактерии

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Особенности генетики бактерий • Бактерии имеют 1 хромосому в форме замкнутого кольца, в суперспирализованной форме в виде петель (12 -80), связанных в центре нуклеоида молекулами 4, 5 S-РНК. • Хромосома бактерий располагается свободно в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. • Бактерии гаплоидны. • Содержание ДНК не постоянно (при благоприятных условиях количество ДНК достигает значений, эквивалентных 2, 4, 6 или 8 хромосомам). • Передача ДНК происходит не только по вертикали, но и по горизонтали. • Имеется дополнительный плазмидный геном.

Строение бактериальной хромосомы

• Геном – совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме или в наборе хромосом данного индивидуума. • Генотип – вся совокупность имеющихся у данного организма индивидуальных генов. • Фенотип – совокупность реализованных у организма генетически детерминированных признаков.

Ген – структурная единица ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру белка. Функции гена: • Непрерывность наследственности. • Управление структурами и функциями организма. • Эволюция организмов (мутации, рекомбинации).

Свойства гена: • Код универсальный (все организмы используют один и тот же код записи генетической информации). • Код триплетный (кодон состоит из трех нуклеотидов). • Код не перекрывающийся (соседние кодоны представлены отдельными самостоятельными триплетами). • Код вырожденный (каждая аминокислота кодируется более чем одним кодоном).

Гены-цистроны Оперон Геноператор Гены-цистроны Геноператор регулятор Оперон Регулон Особенности выражения генетической информации у бактерий

В состав оперонов входят: • Промотор – область, с которой взаимодействует РНК – полимераза. • Энхансер – генетический элемент, усиливающий транскрипцию оперона. • Аттенуатор – генетический элемент, ослабляющий работу оперона. • Терминатор – особый участок в структуре аттенуатора, блокирующий синтез лидерной РНК.

Особенности репликации бактериальной ДНК • Вегетативная репликация – обусловливает передачу генетической информации по вертикали. • Конъюгативная репликация – осуществляется при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами. • Репаративная репликация – устранение из ДНК структурных повреждений.

Вегетативная репликация • Начинается со строго фиксированного сайта хромосомы – ori. C. • Имеет полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается в строго фиксированной точке – terminus. • Репликация на одной из расплетенных нитей – лидерной (ведущей) – идет непрерывно, а на другой – отстающей – прерывисто (через образование сегментов Оказаки).

• ДНК – полимераза III осуществляет синтез ДНК только в направлении 5' – 3'. Поэтому на отстающей цепи ДНК – полимераза III должна возвращаться через образование сегментов Оказаки, чтобы наращивать нить.

Конъюгация – направленный перенос генетического материала от клетки-донора – клетке-реципиенту

Процесс конъюгации у E. coli

Сокращенная хромосомная карта E. coli K-12

Трансдукция – перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов

Трансформация – бактерия-реципиент захватывает из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК в состоянии компетентности. – индуцированная трансформация (искусственное добавление ДНК). – спонтанная трансформация (естественное смешивание генетически различных клеток с получением рекомбинантов). Трансфекция – трансформация бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемая вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой.

Внехромосомные генетические элементы • • Плазмиды. IS – элементы. Транспозоны. Эписомы.

Плазмиды • Внехромосомные генетические элементы. • Репликоны, которые стабильно наследуются в экстрахромосомном состоянии. • Наипростейшие организмы, лишенные оболочки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии, представляют собой класс абсолютных внутриклеточных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами.

Сходство плазмид с вирусами • Не имеют собственной белоксинтезирующей системы. • Нет системы иммобилизации энергии. • Не способны к делению, а размножаются путем саморепликации. • Абсолютные внутриклеточные паразиты.

Отличие плазмид от вирусов • Геном плазмид представлен только двунитевой ДНК; • Не имеют собственной оболочки; • Размножение саморепликацией, не требующей синтеза структурных белков и процесса самосборки; • Среда обитания – только бактерии; • Наделяют бактерии полезными свойствами.

Свойства плазмид • • • Саморегулируемая репликация. Явление поверхностного исключения. Явление несовместимости (Inс-группы). Контроль числа копий. Контроль стабильного сохранения в клетке. Контроль равномерного распределения в дочерние бактериальные клетки. • Способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид). • Способность к мобилизации.

Классификация плазмид F-плазмиды – донорные функции при конъюгации. R-плазмиды – резистентность. Col-плазмиды – синтез колицинов. Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов. D-плазмиды – деградация. Ti-плазмиды – патогенность для растений.

Транспонируемые генетические элементы • IS-элементы, или вставочные последовательности (несут ген, кодирующий белок траспозазу; встраиваются в разные участки хромосомы – IS 1, IS 2, IS 3 и т. д. ) • Tn – транспозоны, сегменты ДНК, содержащие определенные гены – Tn 1, Tn 2, Tn 3 и т. д. • Эписомы – сложные саморегулирующиеся системы, содержащие IS–элементы и транспозоны (способны реплицироваться в автономном состоянии или в интегрированном в хромосому).

Схема форм изменчивости микроорганизмов

Возможные причины диссоциации • Способ расхождения делящихся клеток. • Строение клеточных оболочек (капсула, клеточная стенка, мембрана). • Условия культивирования и хранения. • Генетические процессы (трансформация, трансдукция, плазмиды, транспозоны…).

Источник: https://present5.com/genetika-bakterij-osobennosti-genetiki-bakterij-bakterii/

Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

– наука о закономерностях наследственности и изменчивости микроорганизмов.

Наследственность – способность передавать признаки и свойства м/о от одних поколений

другим.

Единица наследственности – ген

Ген –участок молекулы нуклеиновой кислоты (как правило ДНК/у бактерий/ , РНК /у некото

рых вирусов/ , несущий информацию о специфической структуре 1 белка.

Нуклеиновые кислоты – линейные биополимеры ,состоящие из мономеров-нуклеотидов.

Геном – совокупность генов нуклоида.

Генотип – совокупность генов нуклеоида и плазмид.

У всех живых микроорганизмов 2 типа нуклеиновых кислот:

1) ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота)

-длинная 2-цепочечная молекула ,закрученная в спираль. Универсальный носитель генетической информации , которая записана с помощью генетического кода азотис-

тых оснований (аденин ,гуанин ,цитозин и тимин /А,Г ,Ц,Т/ )

Представляет собой биополимер, который состоит из нуклеотидов.

ДНК имеет первичную и вторичную структуру:

а) Первичная стуктура – линейная последовательность нуклеотидов.

Нуклеотид состоит в свою очередь из одного из азотистых оснований ,дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.

б) Вторичная структура – это 2 комплементарные нити ДНК ,закрученные в двойную

спираль.

Эти нити комплементарны и антипараллельны.

Свойства ДНК:

А) Уникальная способность к cамовоспроизведению-репликации.

-способность к построению второй комплементарной цепи на матрице 1 из цепей.

Т.о. на матричной цепи строится дочерняя по принципу комплементарности при

помощи фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Б) Принцип комплементарности

Напротив Аденина в одной цепи в другой цепи всегда стоит Тимин

Напротив Гуанина в одной цепи в другой цепи расположен Цитозин.

Таким образом дочерняя нить ДНК является зеркальным отображением материнс-

кой (матричной ) ДНК

В) Способность к денатурации при 95⁰С .

Денатурация –потеря вторичной структуры ДНК ,проявляющаяся в расхождении

2-х цепей . При понижении температуры ДНК восстанавливает свою двойную спи-

раль.

Г) Антипараллельность двух нитей ДНК : 1 нить – 3’-5’

2 нить –5’-3’

Принцип строения ДНК универсален для всего живого,но у разных видов ДНК

Отличается по длине , по составу и последовательности оснований нуклеотидов.

Функция: Хранение ,воспроизведение и передача генетической информации.

Вся генетическая информация уникальна и не повторяется.

Реализация в течение всей жизни клетки в виде синтеза белков.

Перед синтезом белка двойная спираль ДНК раскручивается и ее нити расходятся ,на

одной из нитей ДНК(матричной) происходит синтез информационной РНК (транскрипция)

2) РНК (Рибонуклеиновая кислота)

Отличия от ДНК:

– Имеет только первичную структуру – линейная последовательность нуклеотидов.

– В составе нуклеотида вместо дезоксирибозы-рибоза.

– Также состоит из 4 азотистых оснований , но взамен тимина-урацил:

А- У

Г- Ц

– РНК в отличие от ДНК – короткоживущий компонент клетки , выявление рРНК

методом NASBA-ПЦР позволяет выявить жизнеспособныевозбулители.

-У бактерий 3 типа РНК:

· информационная РНК

«Информационный посредник» между ДНК нуклеоида и рибосомой.

· транспортная РНК

В процессе синтеза белка поставляет аминокислоты к рибосомам согласно

информации ,записанной на информационной РНК.

· рибосомальная РНК.

Входит в состав рибосом-органоидов,на которых происходит синтез белка из

-У вирусов 2 типа РНК: геномная +РНК и геномная – РНК

+РНК является информационной РНК и напрямую участвует в синтезе белка.

– РНК не является информационной РНК , на ее матрице синтезируется копия ДНК

при помощи фермента обратной транскриптазы (ревертазы) .

Для большинства вирусов РНК выполняет функцию хранения генетической информации взамен ДНК.

Схема реализации генетического кода:

Ген (ДНК) -транскрипция-РНК -трансляция–белок (фермент/структурный белок) ——признак (наличие жгутика ,токсина ,адгезинов)

Особенности генетики бактерий:

-1 кольцевиднозамкнутая 2-х цепочечная молекула ДНК (нуклеоид)/1 «хромосома»/

– ДНК бактерий имеет только первичную и вторичную структуру ,в отличие

От эукариот ,у которых имеется третичная структура.

-Все гены находятся в постоянной активности на 95%( у эукариот 10% генов)

– Наличие внехромосомных ДНК –плазмид , которые могут передаваться от одной клетке к другой в процессе конъюгации( Плазмиды вирулентности , R-плазмиды) .Могут находится свободно (неактивны) и быть встроенными хромосому-эписома (активны).

– Наличие трех типов РНК как и эукариот (иРНК ,тРНК ,рРНК)

Практическое применение.

Уникальные свойства нуклеиновых кислот , а именно способность к репликации ,

денатурации и восстановлению своей вторичной структуры , транскрипции и тран-

сляции легли в основу разработок молекулярно-генетических методов диагностики

заболеваний человека , в том числе инфекционного генеза.

Генетические (Молекулярно-биологические) методы

Диагностики инфекционных заболеваний.

Основаны на обнаружении нуклеиновых кислот(ДНК, геномной РНК , рибосомальной РНК) возбудителя (бактерий,вирусов ,простейших) в пробе.

Генетические методы:

1) Гибридизационные

2) Амплификационные методы:

– ПЦР (полимеразная цепная реакция)

– Лигазная реакция

– Методы транскрипционно-опосредованной амплификации (NASBAПЦР)

Основной и наиболее распространенный метод-ПЦР(Полимеразная цепная реакция)

Основа реакции- способность ДНК к самопроизведению.

1) Пробоподготовка исследуемого материала:

-центрифугирование (кровь ,моча ,ликвор ,фекалии)

-гомогенизация

2) Экстракция нуклеиновых кислот (Нуклеовыделение) ДНК , РНК ,рибосомальнойРНК:

Разрушение оболочек эпителиальных клеток ,оболочек бактерий и вирусов ,уда-

ление белков ,ингибиторов ПЦР (белки , ДНК-аза) с последующим осаждением

и элюцией нуклеиновых кислот в раствор.

– Термолизис (Экспресс-метод ,ведущий к потери части ДНК ,не подходит для

выделения РНК)

-Осаждение

-Осаждение с магнитным штативом.

При любом способе нуклеовыделение проводится в присутствии ВКО-внутренне-

го контрольного образца (ген глобина человека ,который добавляется в пробирку)

Нуклеовыделение проводится в пробирках с применением хаотропных агентов ,осадителей ,отмывочных растворов и элюирующих растворов.

Нуклеовыделение от 15 мин до 2 часов ,в зависимости от количества образцов и

способа экстракции. Проводится вручную или автоматически (пр «EasyMaq»)

3) Амплификация– многократное увеличение числа копий специфического участка

ДНК.

Амплификация проводится на специальных приборах-амплификаторах(термоцик-

лерах) и амплификаторах с детекцией флуоресцентного сигнала.

Данные приборы позволяют резко изменять температуру согласно протоколу иссле-

дования:

2 типа приборов:

а) Планшетного типа (СFX-96 , ICyqler 5)

б) Роторного типа (RottorGen)

Компоненты реакции ПЦР:

1) Искомая ДНК образца(хромосомная ,плазмидная) ,или РНК (геномная ,рибосо -мальная),

2) Праймеры-олигонуклеотиды (10-30 азотистых оснований),содержащие компле-

ментарную последовательность ДНК к границе специфического участка искомой

ДНК.

При отсутсвии такого участка праймер не прикрепится и ПЦР не начнется.

Термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза (TaqF)

Данный фермент выдерживает колебания высоких температур на всех этапах

амплификации.Активный синтез копий ДНК при температуре 70-72⁰С.

Cмесь нуклеотидов с различными азотистыми основаниями.(А,Г,Ц,Т)

Из нуклеотидов фермент ДНК-полимераза синтезирует копию ДНК.

Олигоуклеотиды-зонды,меченыефлуорофорами (FAM , HEXи пр.) и гасите-

лем .Только для варианта ПЦР в реальном времени (Real-TimePCR)

Cолевой буферный раствор.

Cодержит соли магния для работы полимеразы.

7) Ревертаза (Обратная транскриптаза) –только ПЦР-диагностики вирусных

И т.д.

В среднем от 20 до 45 циклов ( в Real-TimePCRобычно 45)

Рост в геометрической прогрессии на последних циклах замедляется – «

эффект плато» , на что влияет утилизация праймеров ,нуклеотидов ,полимеразы ,количество ингибиторов(праймеров-димеров,конкурирующих за полимеразу) ; неполная денатурация при высокой концентрации специфичес-

ких продуктов.

Время амплификации 1,5-2,5 часа.

Для РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует этап обратной транскрипции

(ОТ) 50⁰С ,продолжительность 30 мин.

· Детекция продуктов ПЦР

По способу детекции выделяют следующие варианты ПЦР:

НК.

Методы выделения ДНК и РНК

Цель экстракции:

-Удаление белков , ДНК или РНК

– Изоляция специфического типа ДНК (или РНК)

Основные требования:

– Низкая трудоемкость

-Быстрота выполнения процедуры

-Максимальное удаление ингибиторов ПЦР

-Минимизация потерь нуклеиновых кислот

– Низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу»

Способы выделения зависят от вида исследуемого материала , от его природы ,характера

и свойств выделяемого объекта.

3 этапа:

Разрушение клеток (лизис)

Кипячение ,использование хаотропных агентов.

Инактивация нуклеаз

Очистка нуклеиновых кислот

Оборудование.

Термоциклеры-приборы ,способные циклически изменять температуру и время на основе

специальной заданной программы.

Амплификаторы отличаются друг от друга системами охлаждения ,способами обогрева ,

режимами регулирования смены температуры ,количеством платформ .

В термоциклере пробирки помещаются в металлический блок ,температура которого изме-

шой скоростью , что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

Современныетермоциклеры приспособлены к использованию тонкостенных пластиковых

пробирок для реакционной смеси , что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и дополнительно сократить время проведения реакции.

Регулирование по матрице , при котором заданный в программе температурный профиль

трактуется как температурный профиль термоблока.

Схема амплификации

Схема амплификации

Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

– наука о закономерностях наследственности и изменчивости микроорганизмов.

Наследственность – способность передавать признаки и свойства м/о от одних поколений

другим.

Единица наследственности – ген

Ген –участок молекулы нуклеиновой кислоты (как правило ДНК/у бактерий/ , РНК /у некото

рых вирусов/ , несущий информацию о специфической структуре 1 белка.

Нуклеиновые кислоты – линейные биополимеры ,состоящие из мономеров-нуклеотидов.

Геном – совокупность генов нуклоида.

Генотип – совокупность генов нуклеоида и плазмид.

У всех живых микроорганизмов 2 типа нуклеиновых кислот:

1) ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота)

-длинная 2-цепочечная молекула ,закрученная в спираль. Универсальный носитель генетической информации , которая записана с помощью генетического кода азотис-

тых оснований (аденин ,гуанин ,цитозин и тимин /А,Г ,Ц,Т/ )

Представляет собой биополимер, который состоит из нуклеотидов.

ДНК имеет первичную и вторичную структуру:

а) Первичная стуктура – линейная последовательность нуклеотидов.

Нуклеотид состоит в свою очередь из одного из азотистых оснований ,дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.

б) Вторичная структура – это 2 комплементарные нити ДНК ,закрученные в двойную

спираль.

Эти нити комплементарны и антипараллельны.

Свойства ДНК:

А) Уникальная способность к cамовоспроизведению-репликации.

-способность к построению второй комплементарной цепи на матрице 1 из цепей.

Т.о. на матричной цепи строится дочерняя по принципу комплементарности при

помощи фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Б) Принцип комплементарности

Напротив Аденина в одной цепи в другой цепи всегда стоит Тимин

Напротив Гуанина в одной цепи в другой цепи расположен Цитозин.

Таким образом дочерняя нить ДНК является зеркальным отображением материнс-

кой (матричной ) ДНК

В) Способность к денатурации при 95⁰С .

Денатурация –потеря вторичной структуры ДНК ,проявляющаяся в расхождении

2-х цепей . При понижении температуры ДНК восстанавливает свою двойную спи-

раль.

Г) Антипараллельность двух нитей ДНК : 1 нить – 3’-5’

2 нить –5’-3’

Рекомендуемые страницы:

Источник: https://lektsia.com/9×1247.html