Тинкториальные свойства бактерий и их использование при микроскопировании

1 Место микробиологии и иммунологии в современной медици не. Роль микробиологии и иммунологии в подготовке врачей-клиницистов и врачей профилактической службы

№ 12 Морфология простейших
Простейшие — эукариотические одноклеточные микроорганиз­мы, составляющие подцарство Protozoa царства животных (Animalia).

Простейшие включают 7 типов, из которых четыре типа (Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliophora, Microspora) имеют представите­лей, вызывающих заболевания у человека. Размеры простейших колеблются в среднем от 5 до 30 мкм.

Снаружи простейшие окружены мембраной (пелликулой) — аналогом цитоплазматической мембраны клеток животных. Не­которые простейшие имеют опорные фибриллы.

Цитоплазма и ядро соответствуют по строению эукариотическим клеткам: ци­топлазма состоит из эндоплазматического ретикулума, митохон­дрий, лизосом, многочисленных рибосом и др.; ядро имеет яд­рышко и ядерную оболочку.

Передвигаются простейшие посред­ством жгутиков, ресничек и путем образования псевдоподий.

Простейшие могут питаться в результате фагоцитоза или обра­зования особых структур. Многие простейшие при неблагопри­ятных условиях образуют цисты — покоящиеся стадии, устой­чивые к изменению температуры, влажности и др.

Простейшие окрашиваются по Романовскому—Гимзе (ядро — красного, ци­топлазма — синего цвета).

Тип Sarcomastigophora.

Подтип Mastigophora (жгутико­носцы) включает следующих патогенных представителей: трипаносому — возбудителя африканского трипаносомоза (сонная болезнь); лейшмании — возбудителей кожной и висцеральной форм лейшманиозов; трихомонады, передающиеся половым пу­тем и паразитирующие в толстой кишке человека; лямблию — возбудителя лямблиоза. Эти простейшие характеризуются нали­чием жгутиков: один — у лейшмании, четыре сво­бодных жгутика и короткая ундулирующая мембрана — у три-хомонад.

К подтипу Sarcodina (саркодовые) относится дизен­терийная амеба — возбудитель амебной дизентерии человека. Морфологически сходна с ней непатогенная кишечная амеба.

Эти простейшие передвигаются путем образования псевдоподий. Питательные вещества захватываются и погружаются в цитоплазму клеток. Половой путь размножения у амеб отсутствует.

При неблагоприятных условиях они образуют цисту.

Тип Apicomplexa. В классе Sporozoa (споровики) па­тогенными представителями являются возбудители токсоплазмоза, кокцидиоза, саркоцистоза и малярии.

Жизненный цикл возбудителей малярии характеризуется чередо­ванием полового размножения (в организме комаров Anopheles) и бесполого (в клетках тканей и эритроцитах человека они раз­множаются путем множественного деления). Токсоплазмы имеют форму полулуний.

Токсоплазмозом человек заражается от живот­ных. Токсоплазмы могут передаваться через плаценту и поражать центральную нервную систему и глаза плода.

Тип Ciliophora. Патогенный представитель — возбудитель ба-лантидиаза — поражает толстый кишечник человека. Балантидии имеют многочисленные реснички и поэтому подвижны.

Тип Microsporaвключает микроспоридии — маленькие (0,5—10 мкм) облигатные внутрик­леточные паразиты, широко распространенные среди животных и вызывающие у ослабленных людей диарею и гнойно-воспалительные забо­левания.

№ 13 Особенности биологии вирусов
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью элек­тронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Форма вирионов может быть раз­личной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиели­та, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги).

Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кисло­ты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболоч­ка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые ши­пы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов нахо­дится матриксный М-белок.

Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии.

Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита).

Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выяв­ляемые под микроскопом при специальном окрашива­нии. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной мик­роскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с извест­ным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм).

Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. име­ют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Минус-нить РНК этих виру­сов выполняет только наследственную функцию.

Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также растения и бактерии.

Являясь основными возбудителя­ми инфекционных заболеваний человека, вирусы также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными пу­тями, в том числе через плаценту (вирус краснухи, цитомега ловирус и др.

), поражая плод человека. Они могут приводить к постинфекционным осложнениям — развитию миокардитов, пан­креатитов, иммунодефицитов и др.

Кроме обычных вирусов, известны и так называемые нека­нонические вирусы — прионы — белковые инфекционные ча­стицы, являющиеся агентами белковой природы, имеющие вид фибрилл размером 10—20×100—200 нм.

Прионы, по-видимому, являются одновременно индукторами и продуктами автономно­го гена человека или животного и вызывают у них энцефалопа­тии в условиях медленной вирусной инфекции (болезни Крейтц-фельдта—Якоба, куру и др.).

Другими необычными агентами, близкими к вирусам, явля­ются вироиды — небольшие молекулы кольцевой, суперспи-рализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие забо­левания у растений.

№ 14 Структура и химический состав вирусов и бактериофагов
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью элек­тронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Форма вирионов может быть раз­личной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиели­та, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги).

Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кисло­ты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболоч­ка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые ши­пы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов нахо­дится матриксный М-белок.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окру­жающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называ­ются сердцевиной.

Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии.

Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита).

Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выяв­ляемые под микроскопом при специальном окрашива­нии. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной мик­роскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с извест­ным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм).

Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. име­ют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Минус-нить РНК этих виру­сов выполняет только наследственную функцию.

Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфициро­ванных клеток, напоминая плазмиды.

Источник: http://stomfaq.ru/1-mesto-mikrobiologii-i-immunologii-v-sovremennoj-medicine-rol/index2.html

Методы микроскопии в микробиологии. Их практическое применение

Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20–30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы.

В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.

Оптический микроскоп.Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые делятся на сухие и иммерсионные.

Сухие объективыс относительно большим фокусным расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10–20 мкм),иммерсионные(лат. immersio – погружение) с фокусным расстоянием – при исследовании более мелких микробов.

При микроскопии иммерсионным объективом х90обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты.

Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигает 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив малого увеличения и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения.

На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро–, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы удаляют салфеткой масло с фронтальной линзы объектива.

Микроскопия в темном поле зрения проводится при боковом освещении и обычно применяется при изучении подвижности бактерий или обнаружении патогенных спирохет, поперечник которых может быть меньше 0,2 мкм.

Этот конденсор задерживает центральную часть параллельного пучка лучей, образуя темное поле зрения.

Краевые лучи проходят через кольцевую щель, попадают на боковую зеркальную поверхность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в его фокусе. Если на пути луча нет каких–либо частиц, он преломляется, падая на боковую зеркальную поверхность, отражается от нее и выходит из конденсора.

Когда луч встречает на своем пути микробы, свет отражается от них и попадает в объектив – клетки ярко светятся.

При этом небольшую каплю материала помещают на предметное стекло и накрывают покровным, не допуская образования пузырьков воздуха.

Фазово–контрастная и аноптральная микроскопияоснованы на том, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления.

Это свойство используют с целью увеличить контрастность изображения прозрачных объектов, какими являются микробы, т. е. для изучения деталей их внутреннего строения.

Световые волны, проходя через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от световых волн, не проходящих через них.

При этом интенсивность света не меняется, а только изменяется фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой.

Для повышения контрастности изображения фазовые колебания при помощи специальной оптической системы превращаются в амплитудные, хорошо улавливаемые глазом.

Препараты в световом поле зрения становятся более контрастными – положительный контраст; при отрицательном фазовом контрасте на темном фоне виден светлый объект. Вокруг изображений нередко возникает ореол.

Большей четкости изображения малоконтрастных живых микробов (даже некоторых вирусов) достигают в аноптральном микроскопе.

Благодаря этому фон поля зрения приобретает коричневый цвет, микроскопируемые объекты имеют различные оттенки – от белого до золотисто–коричневого.

Люминесцентная микроскопияоснована на способности некоторых клеток и красителей светиться при попадании на них ультрафиолетовых и других коротковолновых лучей света.

Люминесцентные микроскопы представляют собой обычные световые микроскопы, снабженные ярким источником света и набором светофильтров, которые выделяют коротковолновую часть спектра, возбуждающую люминесценцию.

Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине–фиолетовый светофильтр (УФС–3, ФС–1 и пр.). На окуляр надевают желтый светофильтр (ЖС–3 или ЖС–18).

Различают собственную (первичную) флюоресценцию и наведенную (вторичную).

Так как большая часть микробов не обладает собственной флюоресценцией, они обрабатываются красителями, способными флюоресцировать (вторичная люминесценция). В качестве флюорохромов используют аурамин (для обработки микобактерий туберкулеза), акридин желтый (гонококки), корифосфин (коринебактерии дифтерии), флюоресцеинизотиоцианат (для мечения антител).

Люминесцентная микроскопия отличается рядом преимуществ: дает цветное изображение и значительную контрастность; позволяет обнаружить живые и погибшие микроорганизмы, прозрачные и непрозрачные объекты; установить локализацию бактерий, вирусов и их антигенов в пораженных клетках организма.

Электронный микроскоп.

В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов в безвоздушной среде, на пути которых находится анод. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая нить, разогреваемая до 2500–2900 °С). Оптические линзы заменены электромагнитами.

Между вольфрамовой нитью и анодом возникает электрическое поле в 30 000–50 000 Вт, что сообщает электронам большую скорость, и они, проходя через отверстие анода, попадают в первую электромагнитную линзу (конденсор).

Электронные лучи на выходе из конденсора собираются в плоскости исследуемого объекта.

Они отклоняются под разными углами за счет различной толщины и плотности препарата и попадают в объективную электромагнитную линзу, снабженную диафрагмой.

Электроны, незначительно отклонившиеся при встрече с объектом, проходят через диафрагму, а отклонившиеся под большим углом – задерживаются, благодаря чему обеспечивается контрастность изображения.

Разрешающая способность электронных микроскопов равна 1,0 –0,14нм

Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Способы окраски спор, жгутиков, капсул, включений.

Методы окраски.

Окраску мазка производят простыми или сложными методами.

Простые заключаются в окраске препарата одним красителем;

Сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение.

Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые).

Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор – анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин.

Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время.

Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Источник: https://stydopedia.ru/1×5239.html

Морфология бактерий и микроскопические методы исследований в микробиологии

Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа мицелийобразующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим все бактерии по форме разделяются на следующие группы.

Кокки — (сферические) клетки: могут быть одиночными (микрококки); и парными (диплококки, например нейссерия); тетракокки, располагающиеся по 4 в форме квадратов; пакетообразные кокки, располагающиеся «этажами» (сарцины); располагающиеся цепочками (стрептококки); образующие бесформенные скопления в виде виноградных гроздьев (стафилококки). Диаметр клеток— 1 -2 мкм.

Палочковидные бактерии — наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 -10 мкм. Такие бактерии часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными (например, энтеробактерии).

Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы – бактерии, изогнутые в виде запятой (холерный вибрион, кампилобактер); спириллы имеют несколько крупных завитков (возбудитель возвратного сыпного тифа); спирохеты имеют вид тонких спиралевидных клеток со множеством завитков и петель (возбудитель сифилиса).

Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток. Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Biggiatoa, Thiotrix)

К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно разветвленный мицелий. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных стадиях роста. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры наблюдается плейоморфизм клеток.

К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий выросты служат для размножения, у других – для прикрепления к субстрату или друг к другу.

Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют клеточной стенки –микоплазмы. В культуре одного вида можно одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные, дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы.

Архебактерии представляют собой группу бактерий с клеточной стенкой уникальной структуры, содержащей специфические химические соединения. Морфологически могут быть неправильной формы, сферическими, палочковидными.

Основные задачи микроскопии:

1. Выявление микроорганизмов в различных материалах.

2. Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце.

3. Изучение некоторых морфологических признаков и структур микро­организмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).

4. Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей.

В микроскопии применяют несколько иммерсионных систем: масляную, глицериновую, водную.

При работе с микроскопом производят следующие действия:

С помощью зеркала и суховоздушного объектива малого увеличения (Х8) добиваются наиболее интенсивного и равномерного освещения поля зрения. В центральной части столика микроскопа устанавливают препарат.

Если дальнейшие исследования проводят с суховоздушным объективом (Х40), то следует прикрыть диафрагму конденсора, перевести револьвер микроскопа на данное увеличение и опустить вниз тубус микроскопа с помощью микровинта до появления в поле зрения микроскопа исследуемых объектов.

Если исследования проводятся с помощью иммерсионной системы (увеличение Х90), то в центр препарата следует нанести каплю иммерсионного масла, осторожно перевести объектив микроскопа вниз таким образом, чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, поднять объектив вверх с помощью макровинта до появления в поле зрения микроорганизмов. С помощью микровинта добиваются максимальной четкости изображения.

После просмотра всех препаратов следует снять масло с иммерсионного объектива, перевести микроскоп на малое увеличение, снять осветитель, опустить конденсор и тубус микроскопа вниз до упора. Хранить микроскоп следует в условиях, предотвращающих попадание пыли на линзы.

Фазово-контрастная микроскопия ценна прежде всего тем, что с ее помощью можно наблюдать живые объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды.

С точки зрения увеличения изображения объекта, никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа.

При отсутствии специального микроскопа обычный световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые изменения световых волн, проходящих через объект в амплитудные. В результате этого живые прозрачные объекты становятся контрастными и видными в поле зрения.

Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля). При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным.

Если в исследуемом препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие объекты.

Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа.

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть ихвнутреннюю структуру.

Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В12 алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией.

Клетки микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500 -1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку.

В зависимости от химического состава клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками.

Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнедеятельности клеток, изучения микроорганизмов в почве, воде и т. д. Проведение люминесцентной микроскопии предполагает использование специальных микроскопов (например, МЛ-2).

Разработанные на основе люминесцентной микроскопиииммунофлю-оресцентные методы используются для визуализации иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии антигена изучаемого объекта и меченых флюоресцентными красителями антител.

Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей.

В современных электронных микроскопах достигается увеличение на экране или пленке в 5000 -15000 раз. Благодаря столь высокому увеличению становится возможным выявление деталей бактериальных структур.

Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования.

Детали внутреннего строения выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал. Предварительно бактерии фиксируют и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого контраста.

Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим, или трансмиссионным.

В сканирующем (растровом) микроскопе, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать сразу трехмерное изображение.

При методе сколов (замораживании-оттаивании) проводят изучение внутреннего строения клеточных мембран.

Клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196 °С) в присутствии криопротектора и используют для получения сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов.

Помимо вышеуказанных, разработаны также и другие методы визуализации:

1. Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур.

2. Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить четкое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. При сочетании с компьютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта.

3. Рентгеновская микроскопия, позитронная эмиссионная томография позволяют наблюдать объекты не в вакууме, а в обычных условиях.

В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий используют окрашенные (зафиксированные) или неокрашенные (нативный материал) препараты (мазки), приготовленные из естествен­ных образцов либо из колоний выросших микроорганизмов.

Процесс приготовления мазка состоит из трех этапов:

а) собственно приготовление мазка: на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды.

Затем на пламени горелки прокаливают петлю до красного каления, мизинцем правой руки открывают у огня пробирку с культурой, после остывания петли (она не должна плавить агар), берут ею небольшое количество культуры.

После этого закрывают пробирку пробкой (через огонь) и эмульгируют бактерии в капле воды так, чтобы она помутнела. Затем прожигают петлю с избытком культуры, охлаждают ее и быстрыми круговыми движениями равномерно распределяют каплю на площади диаметром 15 —25 мм и снова прожигают петлю.

б) высушивание препарата, препарат после высыхания должен быть равномерно тонким. Высушивание можно ускорить, держа препарат высоко над пламенем спиртовки.

в) фиксация мазка: чаще всего осуществляется термически (фламбирование), т. е. над пламенем горелки.

Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к красителям.

Препарат проносят 2-4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение).

Фиксация мазка преследует следующие цели: а) инактивировать микроорганизмы; б) закрепить их на поверхности стекла и предотвратить их смывание при последующем окрашивании; в) повысить восприимчивость клеток к красителям.

Для более детального изучения структуры клеток используют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем их химического сшивания. Наиболее часто в качестве таковых применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др. Мазки фиксируют, помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок.

Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин).

Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя; кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками). Щелочные– связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).

Основные цвета окрашивания могут быть следующими:

а) красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго-красный);

в) синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий);

г) зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).

Способность клеток воспринимать различные красители отражаетих тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки. Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий.

В случае использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне.

Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке.

Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:

Источник: https://megalektsii.ru/s160640t5.html